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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做过反向PCR的筒子进来看一下吧
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shellyxss

金虫 (正式写手)

[求助] 做过反向PCR的筒子进来看一下吧 已有1人参与

我在做反向PCR是时候，方法里面说自身环化以后需要用乙醇沉淀环化产物，这个乙醇沉淀是怎么沉淀的啊？麻烦知道的筒子告知一下呗~谢谢各位啦~
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1楼 2014-06-01 10:21:06
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
就是传统的DNA浓缩。向1体积的质粒溶液加入2.5体积冰置或者-20度放置的无水乙醇，再加入0.1倍 3M、pH5.2醋酸钠溶液,之后将混合液-20度静置30min以上(网上也有-70度放3min，不过我没试过），12000rpm   下4度 离心10min，小心弃去液体，之后再用75%乙醇漂洗一遍，12000rpm离心弃去乙醇后，真空干燥或者室温静置晾干残余乙醇，最后用一定体积的水或缓冲液溶解即可。
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2楼2014-06-01 21:20:27
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
shellyxss: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 太感谢了！ 2014-06-03 08:42:58
引用回帖:
4楼: Originally posted by shellyxss at 2014-06-02 16:10:29
啊，还有配置的醋酸钠溶液是不是需要高压蒸汽灭菌呢？...

高压灭菌和过滤除菌都可以
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6楼2014-06-02 16:26:35
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普通回帖

shellyxss

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-01 21:20:27
就是传统的DNA浓缩。向1体积的质粒溶液加入2.5体积冰置或者-20度放置的无水乙醇，再加入0.1倍 3M、pH5.2醋酸钠溶液,之后将混合液-20度静置30min以上(网上也有-70度放3min，不过我没试过），12000rpm   下4度 离心10 ...

请问为什么需要用醋酸钠溶液啊？
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3楼2014-06-02 15:50:15
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shellyxss

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-01 21:20:27
就是传统的DNA浓缩。向1体积的质粒溶液加入2.5体积冰置或者-20度放置的无水乙醇，再加入0.1倍 3M、pH5.2醋酸钠溶液,之后将混合液-20度静置30min以上(网上也有-70度放3min，不过我没试过），12000rpm   下4度 离心10 ...

啊，还有配置的醋酸钠溶液是不是需要高压蒸汽灭菌呢？
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4楼2014-06-02 16:10:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shellyxss at 2014-06-02 15:50:15
请问为什么需要用醋酸钠溶液啊？...

醋酸钠中的钠离子可以中和掉你DNA上的负电荷从而促进DNA的相互聚集从而促进沉淀。
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5楼2014-06-02 16:24:03
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shellyxss

金虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-02 16:26:35
高压灭菌和过滤除菌都可以...

昨天按照这个方法做了，但是没有看到沉淀，这是正常的吗？
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7楼2014-06-03 08:44:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by shellyxss at 2014-06-03 08:44:10
昨天按照这个方法做了，但是没有看到沉淀，这是正常的吗？...

如果你反向PCR扩增出来的条带并不是太亮的话，加入乙醇没有看到白色沉淀很正常，但你加了水后去测核酸浓度还是可以测到的。如果沉淀效果不好，DNA、乙醇和醋酸钠混合后可以在-20度多放一段时间，我一般都是晚上混合好放-20度放一晚上第二天早上来离心，每次都可以离心下来沉淀。还有你初始DNA的浓度也对后期浓缩影响很大，你的反向PCR做完条带亮吗，割胶回收后是不是又T4酶连了？最好乙醇浓缩前先测一个初始核酸浓度，如果初始浓度就太低的话，乙醇沉淀也很难成功。
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8楼2014-06-03 12:16:14
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shellyxss

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 12:16:14
如果你反向PCR扩增出来的条带并不是太亮的话，加入乙醇没有看到白色沉淀很正常，但你加了水后去测核酸浓度还是可以测到的。如果沉淀效果不好，DNA、乙醇和醋酸钠混合后可以在-20度多放一段时间，我一般都是晚上混合 ...

我现在还没有做反向PCR，现在做的是把单酶切的产物进行连接，连接完后进行乙醇沉淀这一步。还有离心的时候为什么需要保持4℃呢？
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9楼2014-06-03 13:30:50
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by shellyxss at 2014-06-03 13:30:50
我现在还没有做反向PCR，现在做的是把单酶切的产物进行连接，连接完后进行乙醇沉淀这一步。还有离心的时候为什么需要保持4℃呢？...

连接后应该电泳检测不到目标条带吧，你连接体系是多少？连了多长时间？如果你的目标量太少的话确实看不到沉淀，你可以把乙醇换成异丙醇，常温下沉淀效果要好于乙醇。4度的意思就是低温离心，因为温度高的话体系内分子热运动比较活跃更不容易聚集成肉眼能看到的沉淀。
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10楼2014-06-03 14:31:49
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