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bw2318

木虫 (小有名气)

[求助] 肌原纤维蛋白你们是如何提取的? 已有3人参与

小弟提了很多天了, 主要用的是磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液,然后离心提取的。。。。就是没提出来。以下是我的提取步骤:
   准确称量一定量的肉样绞碎,添加肉样量4倍体积的磷酸缓冲液,高速匀浆1min,然后离心15min(2000g、4℃),倒出上清液,重复以上步骤两次。然后用4倍体积的NaCl溶液冲洗沉淀,高速匀浆30s,然后离心15min(2000g、4℃),倒出上清液。将8倍体积NaCl溶液与沉淀混合,并用四层纱布过滤。调整混合溶液的pH为6.2,然后离心15min(2000g、4℃),倒掉上清液,剩余残渣就是肌原纤维蛋白。

个人做预实验中认为有几点问题,不知是否是问题的根源:
1.试剂可能根本提不出力?
2.离心速度不够?
3.纱布过滤时,烧杯外漏了很多液体,是损失了很多蛋白吗? 有经验的前辈是否有过此类经历?
4.调整PH值时,几乎没怎么调整就到等电点了,这没想通。

请前辈们给点意见,以及需要我纠正的地方?拜托了,小弟再不提出来老板就要怒了。
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bw2318

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by woodsorrel at 2014-05-22 20:33:17
你用的应该是Xiong的方法,可以提的出,因为肌原纤维蛋白是盐溶蛋白,不溶于低离子强度溶液,离心力2000 g足够把它离下了。纱布过滤你可以把纱布中间压低点,弄出一个凹面来,少放液体,放在4度慢点过滤。过滤的目的 ...

我是在加热基础上提取的,如你所说用的是xiong的方法,到调节ph时,几乎不用调就到6.2,我就感到很不对了。HCl我用的是0.01M。至于最后测得的性质主要是巯基,晗变,浊度等

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-05-23 08:19:30
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查看全部 9 个回答

答非所问

荣誉版主 (职业作家)

ET.....

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zybpxy: 金币+2, 鼓励专家应助 2014-05-20 10:06:35
我想说两点:1、离心的速度太低,我一般都是8000g 20min
                  2、pH我一般用的6.8.
获取网盘密码请点击:http://emuch.net/bbs/box.php(复制之后,黏贴到浏览器地址栏)
2楼2014-05-20 08:58:39
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bw2318

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 答非所问 at 2014-05-20 08:58:39
我想说两点:1、离心的速度太低,我一般都是8000g 20min
                  2、pH我一般用的6.8.

我们实验室最高转速10000r/min。你的转速可能打不到。我用的试剂都是中性试剂,你的ph为何会那么高

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-05-20 09:01:01
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woodsorrel

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用的应该是Xiong的方法,可以提的出,因为肌原纤维蛋白是盐溶蛋白,不溶于低离子强度溶液,离心力2000 g足够把它离下了。纱布过滤你可以把纱布中间压低点,弄出一个凹面来,少放液体,放在4度慢点过滤。过滤的目的是去掉肌膜、结缔组织,但纱布孔径那么大,对你的蛋白组成没有影响,至于损失的蛋白,你需要计算提取率吗?你说的pH多少是等电点,肌原纤维蛋白的等电点5.0~5.2,你是用多大浓度的HCl调的?这个方法还要注意,你如果后期要看蛋白的结构、变性的话,要冰上操作,包括你前面的取肉样,注意温度。
4楼2014-05-22 20:33:17
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