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r-rainbow铁虫 (小有名气)
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[求助]
甲基化敏感性内切酶 已有2人参与
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最近在做酶切连接，一直连不上，今天一查一个酶为甲基敏感性酶，查了半天也不太理解，求各位大婶解答。 1 甲基化敏感，是说我的片段容易发生甲基化？ 2 如果发生了甲基化，内切酶就不能切开？ 3 如果真是切不开，请各位想想解决的办法。 |
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 分子生物学技术 |
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biostar2009
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r-rainbow: 金币+5, ★★★很有帮助, 学习了 很细致 2014-04-30 17:21:53
silicare: MolEPI+1 2014-05-05 17:35:08
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silicare: MolEPI+1 2014-05-05 17:35:08
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大婶我来了。。。 楼主，看不懂，要么是没有找对看的地方，要么是你视力不够好~  想要系统理解，分子克隆，NEB产品附录，Fermentas产品附录，都有非常详细的解释。 所谓原核生物甲基化，是一个普遍存在的现象，在限制-修饰系统中，被宿主菌用来标记自身和外源DNA。 所谓甲基化敏感的限制性内切酶，是说有一些限制性内切酶，对其识别碱基内，如果出现甲基化修饰碱基，会无法工作。 这有两个问题： 1，刚才说了，甲基化是原核生物DNA普遍存在的现象，那么哪些限制性内酶切会碰到自己的识别序列内有甲基化修饰碱基呢？ 这取决于原核生物DNA甲基化的修饰系统。 Ecoli中最主要的修饰系统有三，根据DNA甲基化酶，称为Dam，Dcm，EcoKI三个系统 Dam识别序列为GATC，对其中的A进行N6甲基化， Dcm识别序列为CCAGG和CCTGG，对其中的C进行C5甲基化， EcoKI识别序列为AAC（A）GTGC和GCAC（A）GTT，对括号内的A进行甲基化。 从识别序列的长度看，可以看出Dam修饰最为频繁。 也就是说，如果在限制性内切酶的识别序列内，或者周围，存在这些修饰序列的时候，限制性内酶切识别序列内就会出现修饰核苷酸，如果这个酶对修饰敏感。就会发生切割受阻。 如果出现在内部阻断，叫完全阻断，这种比较少。 如果不在识别序列内部，而是周围，叫重叠性阻断。 2，受阻的程度如何？ 阻断一般分为完全阻断和部分阻断。 举个例子，经常出问题的XbaI，这是个很好用的酶，但是不注意就会有问题。 XbaI识别TCTAGA 如果环境序列是GA（TCTAGA） 或者（TCTGAG）TC 就出现了GATC的Dam识别序列，注意Dam修饰甲基化是回文的，也就是在DNA两条链上， GA [ T CTAG（A）]TC CT [（A)GATC T ]AG 所以不管是GATCTAGA还是TCTAGATC，都会在TCTAGA内部产生N6-methylA XbaI是完全阻断 所以如果出现这种情况，XbaI在识别位点不能工作。 常见的还有ClaI，ATCGAT，Dam ApaI GGGCCC，Dcm 剩下的自己去看表吧，凡是卖酶的公司都会说 最后的最后，还有一些问题： 哪些来源的DNA会有修饰？ PCR来的肯定不会有修饰，这件事情一定要闹记在心。 常规克隆菌来的DNA，一般都有Dam，Dcm等修饰。 真核生物来的DNA，广泛存在CpG岛修饰。 修饰一定发生吗？？ 原核生物的修饰系统不是100%的，也就是说，并非所有的GATC都会被Dam修饰。 但是限制性内切酶的完全阻断，是完全的。 所有一个常见情况，有时候抽个质粒，酶切回收片段，使命切，过夜切，天天切，还是只有一点掉下来的，这很有可能就是用的一个修饰位点，酶是完全阻断了，但是质粒还是有那么一部分不完全的修饰。 遇到了要怎么办？？？ 有一种菌，专门针对这种情况，进行了Dam，Dcm缺失，比如JM110. 要注意，这种菌，一般存在还有限制系统，就是说，你饱含修饰位点的质粒转进去大部分都会降解掉，所以经常要转很多质粒。理论依据还是那个修饰不完全。总有那么一两个干净的质粒。 还能怎么办？？？？ 同尾酶是一个办法 比如XbaI，同尾酶SpeI 至少还是可以先克隆到，虽然同尾酶连起来大多数情况原来的酶切位点就没了。 |
3楼2014-04-29 12:24:50
zep616745243
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2楼2014-04-29 10:11:18
