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linyingjia至尊木虫 (职业作家)
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噬菌体展示 pcr 没带 什么原因 已有1人参与
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做的噬菌体展示筛选小分子靶点。 经过4轮筛选后，挑取顶层噬菌斑，用10mM EDTA ph8.0 加热裂解噬菌体。 第一次做时，有2个单斑，用噬菌体提供的引物pcr后，有很浓的单一条带。 后来做了很多的单班，什么带没有。和http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6042080&authorid=668860的第一个图很相似。 噬菌体是millipore的pre made t7select噬菌体。按照说明说的方法做的噬菌斑pcr。 pcr没有带是什么原因啊？ 大家谁做过？ |
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 噬菌体展示 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-04-26 17:45:39
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PCR不出现扩增条带的一般原因与对策（2014年4月26日）。 PCR反应的关键环节有（1）模板核酸的制备，（2）PCR反应的循环条件，（3）酶的质量， （4）引物的质量与特异性。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 （1）DNA模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。⑥靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。实在无法确定原因时必须重新提取DNA模板。 （2）Taq 酶等DNA聚合酶失活：更换为保证性高的质量好的新的酶。 （3）改进PCR反应的循环条件： ①PCR反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 可以参考具体的试剂盒的反应说明。 ②变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能不出现扩增带； ③退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 PCR反应体系一般要比较低的Tm的引物的Tm低2到3摄氏度，无扩增带时应在降低2到3摄氏度，两条引物的Tm之差一般不要超过5摄氏度。 ④Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。 （4）引物的质量与特异性：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、不出现的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。重新设计引物是最后一手，如果PCR反应条件都做了调整仍然无效的话。 |
2楼2014-04-26 09:54:32
