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linyingjia

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[交流] 噬菌体展示 pcr 没带什么原因已有1人参与

做的噬菌体展示筛选小分子靶点。
经过4轮筛选后，挑取顶层噬菌斑，用10mM EDTA ph8.0 加热裂解噬菌体。
第一次做时，有2个单斑，用噬菌体提供的引物pcr后，有很浓的单一条带。

后来做了很多的单班，什么带没有。和http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6042080&authorid=668860的第一个图很相似。

噬菌体是millipore的pre made t7select噬菌体。按照说明说的方法做的噬菌斑pcr。

pcr没有带是什么原因啊？

大家谁做过？

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1楼 2014-04-25 22:19:40

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凌波丽

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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-04-26 17:45:39

PCR不出现扩增条带的一般原因与对策（2014年4月26日）。
PCR反应的关键环节有（1）模板核酸的制备，（2）PCR反应的循环条件，（3）酶的质量，（4）引物的质量与特异性。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
（1）DNA模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。⑥靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。实在无法确定原因时必须重新提取DNA模板。
（2）Taq 酶等DNA聚合酶失活：更换为保证性高的质量好的新的酶。
（3）改进PCR反应的循环条件：
①PCR反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。可以参考具体的试剂盒的反应说明。
②变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能不出现扩增带；
③退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 PCR反应体系一般要比较低的Tm的引物的Tm低2到3摄氏度，无扩增带时应在降低2到3摄氏度，两条引物的Tm之差一般不要超过5摄氏度。
④Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。
（4）引物的质量与特异性：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、不出现的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。重新设计引物是最后一手，如果PCR反应条件都做了调整仍然无效的话。

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