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糖包子007

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助：氨基酸标准曲线

谷氨酸
亮氨酸
天冬氨酸
缬氨酸
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1楼2014-03-29 08:38:26
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mao816816

木虫之王 (文坛精英)

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★
糖包子007: 金币+1 2014-04-07 07:51:09
1 实验
1.1 仪器
Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可见分光光度计。
1.2 试剂
正缬氨酸（Norvaline，内标），OPA ，FMOC，均为色谱纯，Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液，Agilent公司提供；
醋酸钠(NaAc)，分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA），四氢呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均为色谱纯，Fisher公司试剂；
氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均为生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂公司；
苯乙烯阳离子交换树脂（732型），天津树脂厂。
1.3 样品处理
将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末，置于广口瓶中备用。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时，过滤，相同浓度的乙醇溶液洗涤，再提取一次，合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱，淋洗液恒温浓缩至干，最后用3ml 0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物，将此溶液离心分离20min，0.45μm微孔滤膜过滤，加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1，定容至50ml，HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析。
样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样。程序为：吸取5μl硼酸缓冲液，再吸取1μ1 OPA试剂，洗针一次，吸取样品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC试剂，洗针一次，原位混合3次，进样。
1.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流动相A：1.36±0.025g醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀。
流动相B：1.36±0.025g醋酸钠，加入100ml纯水溶解，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均匀。
流速：0.45ml/min
柱温：40℃
紫外检测波长: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：见表1
表1 流动相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法，通过对照保留时间进行定性，对氨基酸的出峰顺序加以确认。
1.6 内标法定量
准确移取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中，再加入250pmol/μ1内标溶液100μl，充分混合，液相色谱分析，仪器自动计算各氨基酸的标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 萃取溶剂的比较
氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂，传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸。实验发现，乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较，提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大，但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大，平均8.51%，其中超过10%的有4个，甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小，平均5.12%，超过10%的只有1个。而且盐酸提取液过滤速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此，本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂。
2.2 乙醇浓度的选择
选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取，测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量，结果如图1。图中显示，在乙醇溶液浓度为80%时，烟样中总游离氨基酸的提取量最大。而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化，因此，选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取。

2.3 不同纯化方法的确定
在最佳乙醇溶液浓度下，分别用活性炭加入提取液吸附杂质、乙醚加入提取液萃取分离杂质、5%磺基水杨酸加入提取液沉淀去除杂质和阳离子交换树脂吸附杂质四种方法进行了纯化实验。结果发现，活性炭作为纯化剂时其色谱图中杂质峰较少，但同时氨基酸峰亦有多个消失，主要是因为活性炭对氨基酸也有较强的吸附，它在吸附杂质的同时也吸附了需要检测的氨基酸，故活性炭不适合作为纯化剂使用。乙醚和5%磺基水杨酸作为纯化剂时，杂质去除不完全，其色谱图均表现为杂质峰较多，湮没了大量氨基酸峰，且基线漂移严重，给定性定量工作带来困难。当用阳离子交换树脂进行纯化时，其色谱图中杂质峰较少，基线平稳，氨基酸峰分离较好，均可以进行定性和定量分析，故本实验选择了阳离子交换树脂作为纯化手段。
2.4 色谱分离
2.5 线性范围及标准曲线
分别取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样加入等体积的250 pmol/μ1的内标溶液，进行HPLC分析，以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的面积比为纵坐标，得到各个氨基酸的标准曲线，如表2所示。从表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的浓度范围内均有良好的线性，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均大于0.99。
表2 氨基酸的标准曲线
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 线性方程 相关系数
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重现性实验
取云南C2F99烟样做平行实验（n=5），进行烟叶中游离氨基酸含量的检测，结果发现： Asp和 Glu含量的RSD%分别为8.0%和8.6%，这可能是二者的分离度不高引起的；His的RSD%为9.0%，这可能与其含量较低，分离效果不好有关。其它氨基酸含量的RSD%均处在3%～7%。
2.7 回收率实验
用标样加入法进行回收率实验，结果见表3。 Thr的回收率仅为68.0%，原因可能与其含量较少有关；其它15种氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率为93.9%，说明该方法的回收率结果令人满意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g烟样） 样品含量（mg/g烟样） 测定值（mg/g烟样） 差值（mg/g烟样） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
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6楼2014-04-04 12:42:16
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炼狱之火

至尊木虫 (知名作家)

逆水行舟，不进则退

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
糖包子007: 金币+10, 博学EPI+1, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:17:48
以下是本人查到的相关资料，希望可以帮到你（另附标准曲线制作图表）
标准曲线是溶液中氨基酸浓度与溶液吸光度关系的函数曲线。
一般浓度越大，吸收度越高，肯定是正比例曲线，关键还是要看看你是如何测定的？测定数据是什么，测定出的数据的线性如何？
线性非常重要啊，一定要计算一下注明啊，否则一切白搭。
OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词 :光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
那么10mm比色皿测得OD值就应该是5mm比色皿测得OD值的2倍.
国标实验方法：
分别吸取0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml氨基酸工作液于一组25ml容量瓶中，各加水4ml,加水至4ml比较好
，ph8.0磷酸缓冲液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml,在沸水加热15min,，冷却改为迅速冷却
后加水定容至25ml,放置10min后,用5mm比色杯在570nm处测定吸光度.将测得的吸光度与相应的谷基酸浓度绘制标准曲线.
谷氨酸标准液:称取100mg的谷氨酸(纯度不低于99%)溶于100ml水中,作为母液.准确吸取5ml母液,加水定容至50ml作为工作液(1ml含谷氨酸0.1mg)
试液配制部分请再核查:
pH8.0磷酸盐缓冲液:
按GB 8313—87《茶 茶多酚测定》中3.2的规定,配制1/15M磷酸氢二钠(3.2.1)和
1/15M磷酸二氢钾(3.2.2)溶液。然后取1/15M的磷酸氢二钠溶液95mL和1/15M磷酸二氢
钾溶液5mL,混匀。
3.2 2％茚三酮溶液: 称取水合茚三酮(纯度不低于99％)2g,加50mL水和80mg氯化亚锡
(GB638—78,分析纯),搅拌均匀。分次加少量水溶解,放在暗处,静置一昼夜,过滤后加水
定容至100mL。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

注: 制作标准曲线时,所用蒸馏水,必须是二次蒸馏水。

实验遇到失败应该是操作或试剂引起的，我认为最有可能出错的地方有两个：
1. 移取液体时是否是用移液管移的或者是用移液枪移的，特别要提醒的是移液枪会因吸头的影响而导致加样量不准。
2. 沸水加热时是否会蒸干，因为里面溶液量并不多，15分钟可能会蒸发大量水分，使部分茚三酮和氨基酸析出并附在容量瓶壁上而未参加反应。我认为加热时应该把盖子盖上，虽然会被蒸汽冲开，但应马上盖回去，并在加热过程中最好偶尔摇动。
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  • 附件 1 : 氨基酸标准曲线.xls
    • 2014-04-01 18:36:32, 14.5 K
安之若素，甘之如饴
2楼2014-04-01 18:38:26
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lixiaoya8892

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
糖包子007: 金币+1, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:18:12
0.1mg/ml 取1ml到25ml容量瓶，肯定是要定容25ml，稀释25倍，浓度为0.004mg/ml，即4mg/l所以系列标准浓度梯度为 0mg/l，4mg/l，6mg/l，8mg/l，10mg/l，12mg/l
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认真学习！
3楼2014-04-02 10:26:46
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mao816816

木虫之王 (文坛精英)

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
糖包子007: 金币+9, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:18:44
1．原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570 nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。
2．仪器
可见分光光度计。
3.试剂
①2％茚三酮溶液：称取茚三酮1 g于盛有35 mL热水的烧杯中使其溶解，加入40 mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)，搅拌过滤(作防腐剂)。滤液置冷暗处过夜，加水至50 mL，摇匀备用。
②pH 8．04磷酸缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾(KH2P04)4．5350 g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。

注意点：http://1000eb.com/va94

准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)11．9380 g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。
  取上述配好的磷酸二氢钾溶液lO．0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀，即为pH8．04的磷酸缓冲溶液。
  ③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸(如异亮氨酸)O．200 0 g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀。准确吸取此液10．O mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。此为200µg·mL-1氨基酸标准溶液。
4．操作步骤
①样品处理：准确称取粉碎样品5～lO g或吸取液体样品5～10 mL，置于烧杯中，加入50 mL蒸馏水和5 g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40 mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀备测。
②标准曲线绘制：准确吸取200mol·L-1的氨基酸标准溶液O．O、O．5、1．O、1．5、2．0、2．5、3．0 mL(相当于O、100、200、300、400、500、600µg氨基酸)，分别置于25 mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4．O mL然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1 mL，混合均匀，于水浴上加热15 min，取出迅速冷至室温，加水至刻度，摇匀。静置15 min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量(微克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
  ③样品的测定：吸取澄清的样品溶液1～4 mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得对应氨基酸含量。
5．计算
   X= c÷(m×1000) ×100
式中：x——样品氨基酸的含量，µg·(100 g)-1；
    c——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，µg；
    m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
6．说明
  茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法为：取10 g茚三酮溶于40 mL热水中，加入l g活性炭，摇动1 min，静置30 min，过滤。将滤液放人冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2 mL，冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。
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4楼2014-04-03 16:41:50
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