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求助：氨基酸标准曲线
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3楼2014-04-02 10:26:46
炼狱之火
至尊木虫 (知名作家)
逆水行舟，不进则退
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【答案】应助回帖
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糖包子007: 金币+10, 博学EPI+1, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:17:48
糖包子007: 金币+10, 博学EPI+1, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:17:48
以下是本人查到的相关资料，希望可以帮到你 （另附标准曲线制作图表）标准曲线是溶液中氨基酸浓度与溶液吸光度关系的函数曲线。 一般浓度越大，吸收度越高，肯定是正比例曲线，关键还是要看看你是如何测定的？测定数据是什么，测定出的数据的线性如何？ 线性非常重要啊，一定要计算一下注明啊，否则一切白搭。 OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词 :光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。 那么10mm比色皿测得OD值就应该是5mm比色皿测得OD值的2倍. 国标实验方法： 分别吸取0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml氨基酸工作液于一组25ml容量瓶中，各加水4ml,加水至4ml比较好 ，ph8.0磷酸缓冲液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml,在沸水加热15min,，冷却改为迅速冷却 后加水定容至25ml,放置10min后,用5mm比色杯在570nm处测定吸光度.将测得的吸光度与相应的谷基酸浓度绘制标准曲线. 谷氨酸标准液:称取100mg的谷氨酸(纯度不低于99%)溶于100ml水中,作为母液.准确吸取5ml母液,加水定容至50ml作为工作液(1ml含谷氨酸0.1mg) 试液配制部分请再核查: pH8.0磷酸盐缓冲液: 按GB 8313—87《茶 茶多酚测定》中3.2的规定,配制1/15M磷酸氢二钠(3.2.1)和 1/15M磷酸二氢钾(3.2.2)溶液。然后取1/15M的磷酸氢二钠溶液95mL和1/15M磷酸二氢 钾溶液5mL,混匀。 3.2 2％茚三酮溶液: 称取水合茚三酮(纯度不低于99％)2g,加50mL水和80mg氯化亚锡 (GB638—78,分析纯),搅拌均匀。分次加少量水溶解,放在暗处,静置一昼夜,过滤后加水 定容至100mL。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 注: 制作标准曲线时,所用蒸馏水,必须是二次蒸馏水。 实验遇到失败应该是操作或试剂引起的，我认为最有可能出错的地方有两个： 1. 移取液体时是否是用移液管移的或者是用移液枪移的，特别要提醒的是移液枪会因吸头的影响而导致加样量不准。 2. 沸水加热时是否会蒸干，因为里面溶液量并不多，15分钟可能会蒸发大量水分，使部分茚三酮和氨基酸析出并附在容量瓶壁上而未参加反应。我认为加热时应该把盖子盖上，虽然会被蒸汽冲开，但应马上盖回去，并在加热过程中最好偶尔摇动。 |
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2014-04-01 18:36:32, 14.5 K
2楼2014-04-01 18:38:26
mao816816
木虫之王 (文坛精英)
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【答案】应助回帖
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糖包子007: 金币+9, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:18:44
糖包子007: 金币+9, 谢谢 我需要的是高效液相色谱所作的标准曲线 2014-04-04 12:18:44
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1．原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570 nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。 2．仪器 可见分光光度计。 3.试剂 ①2％茚三酮溶液：称取茚三酮1 g于盛有35 mL热水的烧杯中使其溶解，加入40 mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)，搅拌过滤(作防腐剂)。滤液置冷暗处过夜，加水至50 mL，摇匀备用。 ②pH 8．04磷酸缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾(KH2P04)4．5350 g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。 注意点：http://1000eb.com/va94 准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)11．9380 g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。 取上述配好的磷酸二氢钾溶液lO．0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀，即为pH8．04的磷酸缓冲溶液。 ③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸(如异亮氨酸)O．200 0 g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀。准确吸取此液10．O mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。此为200µg·mL-1氨基酸标准溶液。 4．操作步骤 ①样品处理：准确称取粉碎样品5～lO g或吸取液体样品5～10 mL，置于烧杯中，加入50 mL蒸馏水和5 g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40 mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀备测。 ②标准曲线绘制：准确吸取200mol·L-1的氨基酸标准溶液O．O、O．5、1．O、1．5、2．0、2．5、3．0 mL(相当于O、100、200、300、400、500、600µg氨基酸)，分别置于25 mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4．O mL然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1 mL，混合均匀，于水浴上加热15 min，取出迅速冷至室温，加水至刻度，摇匀。静置15 min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量(微克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。 ③样品的测定：吸取澄清的样品溶液1～4 mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得对应氨基酸含量。 5．计算 X= c÷(m×1000) ×100 式中：x——样品氨基酸的含量，µg·(100 g)-1； c——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，µg； m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。 6．说明 茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法为：取10 g茚三酮溶于40 mL热水中，加入l g活性炭，摇动1 min，静置30 min，过滤。将滤液放人冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2 mL，冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。 |
4楼2014-04-03 16:41:50
mao816816
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糖包子007: 金币+1 2014-04-07 07:51:00
糖包子007: 金币+1 2014-04-07 07:51:00
5楼2014-04-04 12:34:46
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