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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 向各位大神请教：想合成一段60bp左右的碱基作为插入序列，如何设计酶切位点
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jhlong

新虫 (初入文坛)

[求助] 向各位大神请教：想合成一段60bp左右的碱基作为插入序列，如何设计酶切位点 已有3人参与

我想合成一段60bp左右的碱基序列作为插入序列，要在两端插入两个不一样的酶切位点，请问是通过合成出具有酶切位点保护碱基的序列后在进行酶切消化还是在合成的时候就直接合成出具有对应粘性末端的碱基序列然后直接插入，免去酶切的步骤？如果是第二种方法得到的含有粘性末端的序列在序列复性时会不会不稳定？
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1楼 2014-03-24 16:20:39
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-24 18:47:20
如果除了酶切位点有要求，其余序列没要求的话，可以试着看看你实验室其他质粒有没有符合这2个酶切位点的可以切下来用。
如果没有或者其余序列有要求，那么还是合成出具有酶切位点保护碱基的序列后在进行酶切回收吧。我个人觉得直接合成出具有对应粘性末端的碱基序列有点不靠谱，因为酶切位点的碱基你没加保护碱基，万一合成的时候漏掉或者多了，你就只能重合，虽然不贵，但时间真的很重要啊，还影响心情。
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2楼2014-03-24 16:38:06
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-24 18:50:33
直接设计酶切位点吧，根据你所使用的表达载体选取限制性内切酶。
注意在你60bp里面不能有你所选取的内切酶的序列，要不然就切乱套了。
基本上就是   保护碱基-内切酶-引物，引物10-20bp左右，注意添加的保护碱基-内切酶-引物不要自我配对，或者配对不那么严重，要不然不容易扩增出来。

之后再切，连接酶连接过夜。
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3楼2014-03-24 16:47:05
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-24 18:50:57
设计好酶切位点，设计好序列，直接合成两条序列退后就能产生粘性末端的那种，不要设计什么保护碱基，那样的话，你得酶切，这么短的序列不好回收
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2014-03-24 18:48:56
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