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金虫 (小有名气)

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[求助] 请大神帮忙，比较着急！已有1人参与

小弟最近在做质粒构建。将两个质粒中的目的片段P1和P2连接到一起。实验方案：以质粒1为模板，扩增P1。而后以P1和另外一个下游引物扩增质粒2得到全长。我们在P1的下游引物设计时候是40bp碱基，前20bp与P1碱基配对，后20bp个是与P2片段碱基互补，我们认为这样就可以将P1和P2连接在一起。

P1片段很容易拿到。下一步PCR时候，产物大小也和我们预期的一样，但是酶切之后没有相应大小目的片段。如图：Marker 都为1kb的，目的片段1910bp，KpnI和EcoRI双酶切后希望是大约1200bp和700bp大小。酶切体系是50微升，酶分别2.5微升。

hp 2014-03-19 17hr 31min.jpg

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好好生活，努力赚钱

1楼 2014-03-20 12:44:50

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

biostar2009

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管辖: 分子生物

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

没空仔细看完你的结果
你这种情况，其实很好办，可以采用做突变的overlap-PCR的思路，
需要2对引物
P1-F，P1-P2-R
P1-P2-F，P2-R
这里所谓的P1-P2-F/R，就是在你要连接的部分，比如P1的最后设计一段，保证跟P1-F可以得到P1全长，然后再带一点P2的部分，同时P2的开头，保证能跟P2-R得到P2的全长，再带上一点P1的部分。整体要求，就是P1-P2这整个部分，最终Tm有58oC以上。
首先得到P1和P2，
然后P1和P2的片段混一起，再以P1-F和P2-R扩得全长
你仔细想，其中所谓的overlap就是P1和P2的片段首先在P1-P2引物处配对，然后延伸，这才是P1-F和P2-R的模板。
这个方法很容易实现的。