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380218013

金虫 (小有名气)

[求助] 请大神帮忙,比较着急! 已有1人参与

小弟最近在做质粒构建。将两个质粒中的目的片段P1和P2连接到一起。实验方案:以质粒1为模板,扩增P1。而后以P1和另外一个下游引物扩增质粒2得到全长。我们在P1的下游引物设计时候是40bp碱基,前20bp与P1碱基配对,后20bp个是与P2片段碱基互补,我们认为这样就可以将P1和P2连接在一起。

P1片段很容易拿到。下一步PCR时候,产物大小也和我们预期的一样,但是酶切之后没有相应大小目的片段。如图:Marker 都为1kb的,目的片段1910bp,KpnI和EcoRI双酶切后希望是大约1200bp和700bp大小。酶切体系是50微升,酶分别2.5微升。

请大神帮忙,比较着急!
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请大神帮忙,比较着急!-1
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没空仔细看完你的结果
你这种情况,其实很好办,可以采用做突变的overlap-PCR的思路,
需要2对引物
P1-F,P1-P2-R
P1-P2-F,P2-R
这里所谓的P1-P2-F/R,就是在你要连接的部分,比如P1的最后设计一段,保证跟P1-F可以得到P1全长,然后再带一点P2的部分,同时P2的开头,保证能跟P2-R得到P2的全长,再带上一点P1的部分。整体要求,就是P1-P2这整个部分,最终Tm有58oC以上。
首先得到P1和P2,
然后P1和P2的片段混一起,再以P1-F和P2-R扩得全长
你仔细想,其中所谓的overlap就是P1和P2的片段首先在P1-P2引物处配对,然后延伸,这才是P1-F和P2-R的模板。
这个方法很容易实现的。
3楼2014-03-20 12:54:25
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380218013

金虫 (小有名气)

上面两个图是一样的,上传有错。都是PCR后的图。下面是酶切后的图。

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2楼2014-03-20 12:47:09
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