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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于重组克隆实验中遇到的比较奇怪的问题
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

[求助] 关于重组克隆实验中遇到的比较奇怪的问题 已有3人参与

最近实验中遇到一个比较奇怪的问题：
在一个载体上用AscI+SmaI切下一片断，将目的基因连上（两端为AscI+SmaI）。目的基因是通过SOE-PCR做的，中间为SfiI酶切位点.
挑单克隆后，重组质粒要比原先的质粒小，而且SfiI切不开。或许有人说这是假阳性，我也知道，但奇怪的在下面。
我用载体上的另一个酶切位点SacI分别单酶切质粒与重组质粒，原先质粒可以切开线性化，而重组质粒却切不开。（两者反应条件一样）
在构建过程中，酶切位点SacI一直没有进行改动。
一位师兄说，可能载体制备的有问题，载体断开了。
我却觉得我重新做了3次都这样，是不是不是载体的问题？？？
请各位分析一下，不胜感激。
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1楼 2014-03-03 22:13:46
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-04 08:41:40
我有点不懂你说的，你后面的一个酶切位点也在目的基因上吗？用的什么载体？为什么用这种方法验证？
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
2楼2014-03-03 22:21:45
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ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
鬼羽帝魂: 金币+4, ★有帮助 2014-05-31 16:45:36
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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17楼2014-03-25 09:41:59
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普通回帖

tzynew
3楼2014-03-03 22:35:02
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doublehaohao
4楼2014-03-03 22:35:46
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-04 08:41:44
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2014-05-31 16:45:13
目的基因片段是通过SOE-PCR做的，你测序过吗？建议测序看看，是否正确
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5楼2014-03-03 23:00:57
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liygmail at 2014-03-03 23:00:57
目的基因片段是通过SOE-PCR做的，你测序过吗？建议测序看看，是否正确

未测过序，老板不让。   PCR回收之后，大小正确，可能里面出错了？
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6楼2014-03-04 10:50:59
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-03 22:21:45
我有点不懂你说的，你后面的一个酶切位点也在目的基因上吗？用的什么载体？为什么用这种方法验证？

后面的酶切位点SacI在载体上，不在目的基因片段里。我用它切是想线性化看看大小而已，结果就切不开了。
载体是PTRAK系列，自己实验室改造了不知多少次了。
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7楼2014-03-04 10:53:18
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-04 10:53:18
后面的酶切位点SacI在载体上，不在目的基因片段里。我用它切是想线性化看看大小而已，结果就切不开了。
载体是PTRAK系列，自己实验室改造了不知多少次了。...

看大小直接跑个电泳图，为什么要先切开再看大小。。。可以把重组质粒跟未重组的质粒一起跑，比较一下大小试试，然后进行PCR验证是否有目的基因插入，这种方法不行吗？
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
8楼2014-03-04 11:55:05
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小月亮1990

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2014-05-31 16:45:23
建议还是要测序的，能知道那个酶切位点是不是真的还在，也许会有突变呢，要不碱基变了，你怎么换条件也是切不开的啊！
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加油
9楼2014-03-04 12:00:07
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liuaynbin007
祝福
10楼2014-03-04 12:44:41
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