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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建出现读码框移位，不知道什么原因，求高手指点。
汕头大学海洋科学接受调剂
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lingbi

银虫 (正式写手)

[求助] 载体构建出现读码框移位，不知道什么原因，求高手指点。 已有3人参与

新学载体构建，很多东西不明白请多指教。

打算用PET28a 做载体用，怎么插进去读码框不移位？我这么做，用NTI 软件，打开线性化，找到开放阅读框，从 Ncol开始有ATG，那么如果我选择BamHI 作为酶切位点，在设计时要补两个碱基才能保证读码框不移位？GGATCCYYATG---------是这样吗？
可是等我将目的基因黏贴替换之后就像上图，不知道怎么就移了移位，（将EcoI ---BamHI选中，replace，黏贴后翻转一下）操作错在哪里了呢？图1、图3 对比。

还想问问，Ncol 位点开始的ATG 后边没有终止子，是不是这一段也加到我的目的蛋白前面了？

第三个问题是软件上的小问题，用NTI软件怎么我在格式上的修改（字体大小、颜色、密码子几个一组）都不能保存？而且有时候没退出，稍微动一下别的窗口之前的格式设置都没有了？请高手指点一下吧。载体构建出现读码框移位，不知道什么原因，求高手指点。
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载体构建出现读码框移位，不知道什么原因，求高手指点。-1
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载体构建出现读码框移位，不知道什么原因，求高手指点。-2
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  • 附件 1 : 读码框移位_软件截图.doc
    • 2014-02-23 12:34:05, 48 K

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1楼 2014-02-23 12:36:12
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xuejunwang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-02-23 23:50:53
lingbi: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-24 12:28:23
下面那条链是编码链，应该不需要加碱基
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Neversaygoodbye
2楼2014-02-23 14:07:22
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xuejunwang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lingbi: 金币+2 2014-02-23 15:16:48
NcoI至BamHI之间的这段氨基酸序列融合在你的蛋白N端
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Neversaygoodbye
3楼2014-02-23 14:08:51
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lingbi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuejunwang at 2014-02-23 14:07:22
下面那条链是编码链，应该不需要加碱基

我知道看下边那条链，但是从Nocl开始数到BamHI刚好缺两位，不补不上我自己的目的蛋白就移位了。BamHI ggatcc,跟上边的接上应该是如下排的吧，麻烦你再给数数，是我哪里数错了？

GG  ATC  CAT  G-----
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4楼2014-02-23 15:16:32
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-23 23:51:04
lingbi: 金币+10 2014-02-24 12:28:33
...
    请参照这张图谱
    http://wenku.baidu.com/view/230f8af7ba0d4a7302763ae4.html
    翻译是从NcoI的ATG开始，所以到BamHI时刚好是GGA翻译为Gly TCC翻译为Ser，所以诚如上边同学所答，不用加碱基，不是看NTI自己弄成的三个三个方式，而是要从ATG开始数的。
    祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
5楼2014-02-23 16:56:09
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xuejunwang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lingbi: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-24 12:28:43
就是就是，起始密码子是ATG
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Neversaygoodbye
6楼2014-02-23 18:35:23
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-23 23:51:15
做融合表达要使表达框不移码你保证前后两个蛋白阅读框一致，你翻译从NcoI的ATG开始不用考虑前面的BamHI位点。
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hehe
7楼2014-02-23 19:23:38
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lingbi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-02-23 16:56:09
...
    请参照这张图谱
    http://wenku.baidu.com/view/230f8af7ba0d4a7302763ae4.html
    翻译是从NcoI的ATG开始，所以到BamHI时刚好是GGA翻译为Gly TCC翻译为Ser，所以诚如上边同学所答，不用加碱基，不是 ...

我明白你的意思了，图我看到了确实在BamHI前边还有一个 ATG，我想问题可能是我用NTI软件时找ORF 设定的问题，没能找到它。
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8楼2014-02-24 12:27:26
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