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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母表达酶发酵无活性
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junmove

铜虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母表达酶发酵无活性

欢迎高手解疑答惑：
本人将一个淀粉酶基因克隆到pPICZαA载体上的多克隆位点内，Sac I 线性化电转后用博莱霉素梯度（100-200ug/ml）的YPD板子筛选阳性转化子，并将几十个转化子全部拿来发酵后检测发酵液活性，在两株菌的发酵液中检测到了较高的淀粉酶活性，将这两株菌保存于甘油管中置冰箱保存。然后将保存的菌活化、发酵，相同的发酵条件，却在发酵液中再也检测不到淀粉酶的活性。做了两次转化，每次都通过转化子发酵检测活性的方法筛选到了重组酵母菌，但用保存的菌再去发酵，就检测不到活性了。哪位高手可以指点一二，为什么保菌后再发酵就无活性了？  
正常培养用的YPD, 表达培养基用的BMMY, 0.5%甲醇诱导表达。发酵用的是 50ml 离心管，发酵体积5ml。

[ Last edited by junmove on 2014-2-19 at 21:08 ]
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1楼 2014-02-19 20:59:34
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
一定要把原来的菌落保存在平板上4℃保存。我实验室做的时候也一直这样，不能冻存后复苏，一复苏就不能表达，只有本来平板上的可以。具体原理我们也不清楚。而且转接到同样抗性的平板后，也会表达不出来……一定只能用原板。

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2楼2015-01-23 20:39:27
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junmove

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-01-23 20:39:27
一定要把原来的菌落保存在平板上4℃保存。我实验室做的时候也一直这样，不能冻存后复苏，一复苏就不能表达，只有本来平板上的可以。具体原理我们也不清楚。而且转接到同样抗性的平板后，也会表达不出来……一定只能 ...

终于来人了！都快一年了，时间过得真快。原板我也试过，行不行现在都忘了，后来也没再往下做。毕业半年了，现在已经不做这块了。谢谢你的帮助！
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3楼2015-01-25 19:02:13
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by junmove at 2015-01-25 19:02:13
终于来人了！都快一年了，时间过得真快。原板我也试过，行不行现在都忘了，后来也没再往下做。毕业半年了，现在已经不做这块了。谢谢你的帮助！...

哈哈～我也是无意中看到帖子，觉得心有戚戚焉啊，没注意时间就回复了～敢你现在工作呀？感觉咱俩方向相近，我也快找工作了～

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4楼2015-01-26 10:24:11
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junmove

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-01-26 10:24:11
哈哈～我也是无意中看到帖子，觉得心有戚戚焉啊，没注意时间就回复了～敢你现在工作呀？感觉咱俩方向相近，我也快找工作了～
...

工作半年了，现在做的发酵，分子这块看来是要荒芜了
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5楼2015-01-26 20:54:26
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