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5‘Race验证miRNA靶点的原理 已有2人参与
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大家好，近期内急需做验证miRNA靶点的实验，考虑要用RACE，但是首次接触，感觉很多问题想不明白， 头都要涨破了，于是在自己继续摸索的同时，想请有这方面经验的虫友赐教，先表示感谢  1.我研究的物种是一个基因组没测过序的，但有其对应的转录组，这样可否进行实验验证？ 2.如果可以，那么动物miRNA怎么在对应的转录本里找寻相对应的靶标序列（种子序列完全互补？其余序列 允许几个错配？大概需要上下几kb?）？ 3.miRNA应该跟mRNA 3‘UTR结合，那为什么要用5’RACE (主要是扩5‘UTR)，而不是用3’URT？是因为反转录 出来的cDNA跟实际的mRNA是互补的吗？如果是这样，那么特异性引物设计的时候应该是跟mRNA序列一致 的而非反向互补吧。 4.具体试剂盒考虑买Takara的，不知道其效果怎样？大概多久能出结果？ 5.有没有动物中做5‘RACE验证miRNA靶标相关的文献可以推荐？ 这些问题时本人怀着极其虔诚而又焦虑的心情写下的，怕写少了，见这不明所以；写的多了，又觉啰嗦，请亲们不吝赐教吧！ 搬个小板凳在线等~~~  : |
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 出国！！ | miRNA测序数据分析 | 虫友问答-分子生物 |
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silicare: 回帖置顶 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代发): 金币+50, 楼主奖励 2014-02-25 17:35:55
silicare: 回帖置顶 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代发): 金币+50, 楼主奖励 2014-02-25 17:35:55
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如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。 我翻翻以前的文字....贴下面吧： 这里不建议进行蓝白斑筛选。因为5'RACE片段一般较短且在编码区，该片段插入T载体后很可能（17 % ～ 100 %的概率）并不打断LacZ基因的ORF，因而蓝白斑筛选并无太大意义，反而可能使人选择性地避开蓝斑而漏检部分有效的片段。 然后是5'RACE的一些原理，水平有限，仅作参考： 生物体内RNA由于受RISC切割等原因，会断裂成截断的片段。若想对切割的位点进行检测，需要检测出“3'端断裂产物”的5'末端碱基序列，即可推测出切割位点，而这可以通过进行RLM-5'RACE实验实现。理论上对“5'端断裂产物”进行3'RACE能实现同样的目的，但因为RNA一般从3'端开始降解，故对更稳定的5'端进行RACE实验更为合适。 检测断裂位点的RLM-5'RACE实验步骤比检测全长的5'RACE简单，简述如下：提取RNA，给RNA连上人工接头，按常规流程进行逆转录，根据接头序列及目标RNA的已知序列合成引物对逆转录产物进行PCR，PCR产物送测序，分析测序结果。 其中有以下细节需要了解： 接头是否能顺利连接？如何防止接头的自连？RNA被RISC切割后，断裂形成的5'端带有Pi-基团，因此可以在RNA Ligase的作用下与人工合成的RNA接头（单链RNA短片段）连接。人工合成的RNA接头由于两端都是OH-基团，不会发生自连，也不会与RNA的3'端连接。而且由于添加的RNA接头是过量的，因此RNA断裂片段间的连接可以忽略。综上，可以保证连接产物绝大部分为“RNA接头--断裂的RNA片段”。 RNA接头如何设计？接头的设计并未找到什么指导原则，有兴趣可以再翻翻文献。但已知有以下几点：商业化试剂盒里的接头很少会形成发夹环或者二聚体结构，为保险起见自行设计时也应避免形成二级结构。接头3'端应以AAA结尾，因为据文献报道3'端为A能提高连接效率，连续三个A能保证即使接头由于降解或合成缺陷而缺失一两个碱基，末尾仍然是A。RNA接头可以尽量长，以便在其上设计引物，但一般公司似乎只能合成45 nt，这也可以满足实验要求。 SMART-5'RACE并不适用于本实验，因为该技术对断裂的RNA片段不敏感，具体原因可以参看SMART RACE的说明书。至于其它RACE技术是否适用，需具体情况具体分析。 为什么5'RACE能说明miRNA对靶标RNA的切割？ 体内RNA由于各种原因，常会在不同位点断成长短不同的片段。假如一个RNA没受到什么位点特异的机制对其降解，那么我们如果对其进行5'RACE，可以很合理地推测会检测到很多不同大小的片段，而且这些片段的亮度应该都差不多。 但假如我们做完5'RACE以后发现，某个长度的片段（对应RNA某个位点的断开事件）特别亮，那么我们就可以很合理地推测这个RNA似乎是受到某种位点特异的降解机制调控的。 假如幸运地发现，那个特别容易断开的位点正好被预测是能与miRNA结合的，那么我们就可以很有把握地推测这个位点的断开事件其实都是这个miRNA的功劳。 呃.....不过有意找茬的时候也可以说这只是巧合： 假如一条RNA 2000 nt； 假如在那上面预测到一个miRNA的结合位点； 假如由于随机和巧合的原因，任意一条RNA上总有那么1~2个位点相对而言特别容易断开； 那么这个特别容易断开的位点正好位于预测的miRNA结合位点中间2个碱基上时的概率是1/（2000/2/2）=0.2% 这个概率不算大，但也并非完全没有可能。 |
20楼2014-02-25 16:34:08
【答案】应助回帖
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傲雪清霜: 金币+28, ★★★很有帮助, 很有用的答复，谢谢你的热心回答^_^～ 2014-02-19 14:55:59
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-02-19 17:19:18
gyesang: 回帖置顶 2014-02-23 23:49:08
傲雪清霜: 金币+28, ★★★很有帮助, 很有用的答复，谢谢你的热心回答^_^～ 2014-02-19 14:55:59
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-02-19 17:19:18
gyesang: 回帖置顶 2014-02-23 23:49:08
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1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据，就是说，要知道miRNA和（预测的）靶基因在你要研究的物种里的数据（这是显而易见的，否则根本没法设计引物）。 2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?function=3，操作很简单。动物的你自己找找吧，照理说动物的资源比植物的多得多。 3、引物断裂物的5'末端比较稳定。5'RACE只是指扩展5'端，不特指扩5'UTR。特异引物设计应与mRNA序列反向互补。这与cDNA和mRNA是否互补没有关系，这个必须搞明白，请仔细回顾一下PCR的过程。 4、试剂盒没用过，应该都无问题。运气好，第一天提RNA，连RNA接头；第二天逆转录，做巢式PCR，跑胶回收目的条带；第三天测序；第四天分析结果......运气好的话。 5、我做植物的，不知道。印象中5'RACE实验在动物中不是主流。 问题写多了好，啰嗦总比使人莫名其妙强。 |
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傲雪清霜6楼2014-02-19 09:08:42
7楼2014-02-19 15:13:15
10楼2014-02-19 17:03:42
kaixinla168
银虫 (正式写手)
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2楼2014-02-17 08:25:56
，谢谢看帖，送个小红花 3楼2014-02-17 17:47:16
yipan 
铜虫 (职业作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
傲雪清霜(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-02-18 11:47:22
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
傲雪清霜(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-02-18 11:47:22
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转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。 应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。派森诺生物提供mRNA的转录本表达分析，通过获得研究对象基因组转录区域的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。 一、技术路线 转录组的高通量测序包含两部分内容：①有参考基因组的转录组分析(Transcriptome analysis with reference genome)；②无参考基因组的转录组分析(De novotranscriptome analysis)。 1、有参考基因组的转录组分析技术路线 优选平台：Illumina HiSeq测序平台采用双端测序方法，单次测序获得的数据量大，能够得到更高的覆盖深度，检测更多低丰度的转录本。Illumina MiSeq测序平台操作灵活，不需要跟别的样本凑足一个Run，只要您的样品准备好了，平台马上能为您运行。 派森诺生物Illumina 测序平台结合成熟的生物信息学分析系统，是基因组序列已知物种的转录组分析的最佳选择。 总RNA样品 mRNA富集 片段化mRNA 随机引物cDNA合成 上机测序 数据质控 生物信息学分析 高质量测序数据 2、无参考基因组的转录组分析 优选平台：在Roche 454 FLX基础上发展起来的Roche 454 FLX+，有着成熟的分析软件和分析流程，具有长度长的优势，易于后续拼接和生物信息分析，提供最接近转录本长度的高通量测序数据。 总RNA样品 mRNA富集 片段化mRNA 随机引物cDNA合成 454 FLX+上机测序 De novo组装 数据质控 生物信息学分析 高质量测序数据 二、生物信息学分析 1）有参考基因组的转录组 a)原始数据统计和处理 b)map到基因组 c)基因组注释整理及表达量分析 d)表达差异分析 e)表达差异GO聚类分析 f)基因覆盖分析 g)SNP分析 h)KEGG pathway分析 i)可变剪切分析 j)基因结构优化以及新基因发现 2）无参考基因组的转录组 a)原始数据统计和处理 b)Contig和Unigene统计分析 c)Unigene功能注释 d)表达差异分析 e)表达差异GO聚类分析 f)KEGG pathway分析 g)SNP分析 h)SSR分析 三、 常见问题解答 1、Q: 转录组测序与其他方法相比有哪些优势？ A: 相对于传统芯片而言，转录组测序应用范围广，无需预先设计探针或了解物种的基因信息，即可对任意物种进行转录组测序，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，同时能发现新的转录本，预测新的基因，检测可变剪切，SNPs，融合基因等，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。 技术 芯片技术 cDNA/EST测序 转录组测序 手段 杂交 一代测序 二代测序 分辨率 ＜100bp 单个碱基 单个碱基 通量 较高 低 高 是否依赖参考序列 是 否 否 背景噪音 强 弱 弱 检测灵敏度 低 高 高 需提供的RNA总量 高 高 低 2、Q: 进行转录组测序有哪些注意事项？ A: 1)RNA的质量好坏会严重影响测序的质量： ①RNA的3’端发生降解，则无法通过3’端的poly A尾捕获mRNA，反转录后进行测序也无法得到全部的cDNA； ②若RNA的5’端发生降解，即使通过3’端的poly A捕获得到mRNA，测序结果也将出现明显的3’和5’偏向性。 2)若RNA浓度较低时，也会影响测序的质量。可通过增加PCR扩增循环数的方法获得足够的量用于后续测序。 3)测序信号和准确性会因文库中poly A多聚物的存在发生一定的偏差。 3、Q: 如何进行原核生物转录组分析？ A: 针对原核生物的mRNA没有poly A尾巴的情况，需要提供纯化后的原核生物mRNA或cDNA样品。 4、Q: 对于有参考基因组序列和没有参考基因组序列的情况，派森诺生物曾做过哪些物种的转录组测序分析？ A: 派森诺生物已与国内外多个知名的高校与研究所开展了多种模式生物及主要农作物的转录组分析，例如玉米、鸡和人等十几个物种，从这些转录组的分析研究中发现了很多新结构、新基因，派森诺生物也做过多种无参考基因组物种的转录组测序和分析，包括鹅，绿藻等，为这些物种的深入研究奠定了良好的基础。 5、Q: 转录组测序需要多少测序量？ A: 转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。①针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；②针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。 |
4楼2014-02-18 10:40:11
kaixinla168
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