应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5‘Race验证miRNA靶点的原理
131/2返回列表12下一页
查看: 11535  |  回复: 40
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)

[求助] 5‘Race验证miRNA靶点的原理 已有2人参与

大家好，近期内急需做验证miRNA靶点的实验，考虑要用RACE，但是首次接触，感觉很多问题想不明白，
头都要涨破了，于是在自己继续摸索的同时，想请有这方面经验的虫友赐教，先表示感谢

1.我研究的物种是一个基因组没测过序的，但有其对应的转录组，这样可否进行实验验证？

2.如果可以，那么动物miRNA怎么在对应的转录本里找寻相对应的靶标序列（种子序列完全互补？其余序列
   允许几个错配？大概需要上下几kb?）？

3.miRNA应该跟mRNA 3‘UTR结合，那为什么要用5’RACE (主要是扩5‘UTR)，而不是用3’URT？是因为反转录
   出来的cDNA跟实际的mRNA是互补的吗？如果是这样，那么特异性引物设计的时候应该是跟mRNA序列一致
   的而非反向互补吧。

4.具体试剂盒考虑买Takara的，不知道其效果怎样？大概多久能出结果？

5.有没有动物中做5‘RACE验证miRNA靶标相关的文献可以推荐？

这些问题时本人怀着极其虔诚而又焦虑的心情写下的，怕写少了，见这不明所以；写的多了，又觉啰嗦，请亲们不吝赐教吧！
搬个小板凳在线等~~~:
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

出国！！ miRNA测序数据分析 虫友问答-分子生物

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
1楼 2014-02-15 22:26:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by kaixinla168 at 2014-02-17 08:25:56
很专业的问题，不懂

，谢谢看帖，送个小红花
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
3楼2014-02-17 17:47:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据，就是说，要知道miRNA和（预测的）靶基因在你要研究的物种里的数据（这是显而易见的，否则根本没法设计引物）。

2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/p ...

谢谢，确实如你所说，动物中很少用RACE的，我找到的文献大多是植物相关的，可能跟动物miRNA靶点较多有关。还有几个问题不是很明白，希望得到你的指点～

1.我在相应的转录组找到了miRNA与其靶点的结合处，上游正向引物试剂盒自带的，下游特异性引物应该设在这个结合点后大约多少bp？有没有专门检验自己设的特异性引物跟试剂盒已知引物是否适合？

2.最后巢式PCR跑出几条带正常？挑克隆时是挑哪条带？5'RACE目的是扩基因的5'全长，貌似跟RACE验证miRNA的原理有些差异，但我想不明白？能否给我解释一下？

万分感激～
赞一下(1人) 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
7楼2014-02-19 15:13:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 16:12:24
动物做RACE的少，是因为据说大部分情况下，动物microRNA对RNA进行翻译抑制，并不切断RNA，也就不能做RACE了。

1、我自己会选250～1000。为的是跑胶和PCR都比较方便。检验一般不做吧，设计引物的时候注意和上游引 ...

👌，谢谢～
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
9楼2014-02-19 16:28:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by Carnity at 2014-02-19 17:03:42
最近也在关注microRNA的做法，还没着手做，先收个贴，灌个水，以后整明白了别忘了教教我哈

共同学习~
回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
11楼2014-02-21 12:40:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 16:12:24
动物做RACE的少，是因为据说大部分情况下，动物microRNA对RNA进行翻译抑制，并不切断RNA，也就不能做RACE了。

1、我自己会选250～1000。为的是跑胶和PCR都比较方便。检验一般不做吧，设计引物的时候注意和上游引 ...

你好，又有个问题需要向你请教一下，你做的时候有没有对连接好接头的RNA进行变性处理，在进行后续试验啊？立体结构复杂的基因怎么定义的？谢谢~
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
12楼2014-02-21 16:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by zhangxn at 2014-02-23 16:13:23
你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒，扩增的条带基本与自己预测到的是一致的，但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教...

你好，你有没有做去磷酸化和去接头那两步啊？我直接总RNA加接头，结果outer PCR除了引物二聚体，嘛都没有，今天又在做control了，看看是不是操作问题~
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
16楼2014-02-24 09:52:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-21 18:15:41
RNA连好接头后直接按照逆转录酶的说明进行操作了。
你用试剂盒的话按试剂盒的做应该就可以了吧。逆转录前会有个高温处理步骤吧？
我也不知道立体结构复杂的基因怎么定义。也许你可以用RNAstructure等程序分析一下 ...

你好，你验证靶标时有没有做去磷酸化和去接头那两步啊？我直接总RNA加接头，结果outer PCR除了引物二聚体，嘛都没有，今天又在做control了，不知道是操作问题还是模版问题~
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
17楼2014-02-24 11:25:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 12:55:23
没有。第一轮PCR没有也正常，第二轮PCR有就好。最好每次都做1个正对照以防操作或者试剂有问题。

我做得比较粗放：
提总RNA
直接取1ug，加接头、酶等连接
直接取1uL连接物逆转录
直接取0.5uL逆转录物做PCR...

对哦，第一轮只跑了20个循环，表达量不高的话是看不到带的，第二轮有带了，都不太长，1000bp以下，切胶回收了，准备做连接。但是我搞不明白挑克隆怎么来说明靶标的某个位置是miRNA的切割位点，因为我们没有去磷酸化，那理论上包含目的靶标序列的片段应该有很多才对，而我们切出来的带应该是特定大小的DNA片段。参考文献上6/10这样的标志实际含义到底是什么啊？是直接挑白斑测序看有没有目的靶基因呢？还是包含完整靶标和不完整靶标的比例？我实在搞不明白这个原理，还有需不需要菌液PCR啊？谢谢～
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
19楼2014-02-25 13:09:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

感激之情不以言表，是我查询很久对RLM-5'RACE原理最详细的说明，感谢XOooZzz虫友的热心答复，也感谢小木虫这个平台^_^！
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
21楼2014-02-25 18:33:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 傲雪清霜 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭