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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 验证miRNA对靶基因剪切位点的RLM-RACE的效率问题
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 验证miRNA对靶基因剪切位点的RLM-RACE的效率问题已有1人参与

用T4 RNA连接酶介导的5‘ RACE（RLM-RACE）验证验证miRNA对靶基因剪切位点，也得到了断裂位点在两者互补区域处的几个克隆，但大部分克隆显示空载体，也有的显示在其他位置，关于这个效率问题，还请多多指教
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太阳出来，星星要走。
1楼2013-06-02 09:06:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我用的宝生物的盒子，就是把锚定物TAP用T4 RNA连接酶连到你的mRNA上，注意的是不要进行去帽和磷酸化反应，直接连上之后反转录，之后用内外两层锚定引物和你基因下游的两段特异性引物进行巢式PCR，（设计特异引物的时候注意控制目的片段在200bp左右），扩出目的片段之后连接到克隆载体上测序，因为TAP的序列是已知的，所以拿到测序结果之后把TAP的序列去掉，剩下的序列和你完整mRNA的序列进行对比，就可以找到剪切位点

做RACE之前，你的mRNA样品一定要进行基因组DNA去除反应！！！
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9楼2014-06-07 15:04:35
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普通回帖

昺昺

木虫 (小有名气)
做这个实验，我用的是promega的mRNA富集试剂盒和invitrogen的 GeneRacer Kit,是不是我之后用的酶进行巢式PCR的体系优化问题？还是合成的cDNA的完整性问题？我已经重新合成过两次cDNA 1L，结果都是如此
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太阳出来，星星要走。
2楼2013-06-02 09:10:34
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昺昺

木虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 楼主你自己不要顶来顶去的哇，你一下子就回复了俩下，把页面给推到下面了这个习惯不好，希望能有所改变。期待小虫子能给你满意的答案 2013-06-02 13:28:07
自己顶一下
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太阳出来，星星要走。
3楼2013-06-02 12:53:29
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昺昺

木虫 (小有名气)
继续等待大虾解答
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太阳出来，星星要走。
4楼2013-06-04 16:17:34
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昺昺

木虫 (小有名气)
求助ing
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太阳出来，星星要走。
5楼2013-06-12 18:01:26
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zhangxn

铜虫 (小有名气)
是不是这个技术体系还不是很成熟 很多这样的帖子都没有人回答 最近我也遇到很多这样的问题   求高手啊
高手在哪里啊
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6楼2014-02-23 16:19:30
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zhangxn

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-06-02 09:10:34
做这个实验，我用的是promega的mRNA富集试剂盒和invitrogen的 GeneRacer Kit,是不是我之后用的酶进行巢式PCR的体系优化问题？还是合成的cDNA的完整性问题？我已经重新合成过两次cDNA 1L，结果都是如此

请问你的 问题解决了吗
?
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7楼2014-02-23 16:20:52
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佳忆ZJU

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-06-02 09:10:34
做这个实验，我用的是promega的mRNA富集试剂盒和invitrogen的 GeneRacer Kit,是不是我之后用的酶进行巢式PCR的体系优化问题？还是合成的cDNA的完整性问题？我已经重新合成过两次cDNA 1L，结果都是如此

promega的mRNA富集试剂盒和invitrogen的 GeneRacer Kit这两个试剂盒的货号可以给我发一下吗，我也想做这个实验，谢谢！
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8楼2014-06-07 10:02:05
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渡微光

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-06-07 15:04:35
我用的宝生物的盒子，就是把锚定物TAP用T4 RNA连接酶连到你的mRNA上，注意的是不要进行去帽和磷酸化反应，直接连上之后反转录，之后用内外两层锚定引物和你基因下游的两段特异性引物进行巢式PCR，（设计特异引物的时 ...

你好，我也打算订宝生物的试剂盒。请问为什么不用进行去磷酸化反应和去帽反应，还有为什么目的片段要控制在200bp 左右，因为有人说，引物离剪切位点至少要200bp ？
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10楼2014-10-23 17:14:46
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