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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 验证miRNA对靶基因剪切位点的RLM-RACE的效率问题
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 验证miRNA对靶基因剪切位点的RLM-RACE的效率问题 已有1人参与

用T4 RNA连接酶介导的5‘ RACE（RLM-RACE）验证验证miRNA对靶基因剪切位点，也得到了断裂位点在两者互补区域处的几个克隆，但大部分克隆显示空载体，也有的显示在其他位置，关于这个效率问题，还请多多指教
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太阳出来，星星要走。
1楼 2013-06-02 09:06:42
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我用的宝生物的盒子，就是把锚定物TAP用T4 RNA连接酶连到你的mRNA上，注意的是不要进行去帽和磷酸化反应，直接连上之后反转录，之后用内外两层锚定引物和你基因下游的两段特异性引物进行巢式PCR，（设计特异引物的时候注意控制目的片段在200bp左右），扩出目的片段之后连接到克隆载体上测序，因为TAP的序列是已知的，所以拿到测序结果之后把TAP的序列去掉，剩下的序列和你完整mRNA的序列进行对比，就可以找到剪切位点

做RACE之前，你的mRNA样品一定要进行基因组DNA去除反应！！！
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9楼2014-06-07 15:04:35
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昺昺

木虫 (小有名气)
做这个实验，我用的是promega的mRNA富集试剂盒和invitrogen的 GeneRacer Kit,是不是我之后用的酶进行巢式PCR的体系优化问题？还是合成的cDNA的完整性问题？我已经重新合成过两次cDNA 1L，结果都是如此
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太阳出来，星星要走。
2楼2013-06-02 09:10:34
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昺昺

木虫 (小有名气)
继续等待大虾解答
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太阳出来，星星要走。
4楼2013-06-04 16:17:34
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zhangxn

铜虫 (小有名气)
是不是这个技术体系还不是很成熟 很多这样的帖子都没有人回答 最近我也遇到很多这样的问题   求高手啊
高手在哪里啊
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6楼2014-02-23 16:19:30
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