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昺昺

木虫 (小有名气)

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[求助] 验证miRNA对靶基因剪切位点的RLM-RACE的效率问题已有1人参与

用T4 RNA连接酶介导的5‘ RACE（RLM-RACE）验证验证miRNA对靶基因剪切位点，也得到了断裂位点在两者互补区域处的几个克隆，但大部分克隆显示空载体，也有的显示在其他位置，关于这个效率问题，还请多多指教

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太阳出来，星星要走。

1楼 2013-06-02 09:06:42

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快乐农夫

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

我用的宝生物的盒子，就是把锚定物TAP用T4 RNA连接酶连到你的mRNA上，注意的是不要进行去帽和磷酸化反应，直接连上之后反转录，之后用内外两层锚定引物和你基因下游的两段特异性引物进行巢式PCR，（设计特异引物的时候注意控制目的片段在200bp左右），扩出目的片段之后连接到克隆载体上测序，因为TAP的序列是已知的，所以拿到测序结果之后把TAP的序列去掉，剩下的序列和你完整mRNA的序列进行对比，就可以找到剪切位点

做RACE之前，你的mRNA样品一定要进行基因组DNA去除反应！！！