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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5‘Race验证miRNA靶点的原理
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

感激之情不以言表，是我查询很久对RLM-5'RACE原理最详细的说明，感谢XOooZzz虫友的热心答复，也感谢小木虫这个平台^_^！
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有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
21楼2014-02-25 18:33:40
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-25 18:33:40
感激之情不以言表，是我查询很久对RLM-5'RACE原理最详细的说明，感谢XOooZzz虫友的热心答复，也感谢小木虫这个平台^_^！...

哦，不用客气，也就粘贴了一下以前的东西.
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22楼2014-02-25 19:01:14
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

你好，为嘛胶回收后跑胶验证是单一目的条带，但以此为模板在进行PCR又会出现杂带？如果主条带比目的条带亮很多的话，可不可以直接PCR产物测序啊？
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23楼2014-02-26 13:38:27
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-26 13:38:27
你好，为嘛胶回收后跑胶验证是单一目的条带，但以此为模板在进行PCR又会出现杂带？如果主条带比目的条带亮很多的话，可不可以直接PCR产物测序啊？...

引物特异性不好？或者回收时夹杂了一些别的片段？
你的意思是主条带不是目的条带？而且主条带很亮？
直接PCR产物测序可以看看你选的测序公司的要求呃，有的可以，有的要求没有杂带.
杂带很多的话试试直接连T载体送菌落测序
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24楼2014-02-26 15:51:26
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-26 15:51:26
引物特异性不好？或者回收时夹杂了一些别的片段？
你的意思是主条带不是目的条带？而且主条带很亮？
直接PCR产物测序可以看看你选的测序公司的要求呃，有的可以，有的要求没有杂带.
杂带很多的话试试直接连T载体 ...

主条带是目的条带很亮，但是还有其他肉眼可见条带，华大测的，据说可以。
最后挑好的单克隆直接测序就好了吧？如果菌液PCR后测序貌似没多大意思？
之前的问题你回答的很详细，可能由于我没有表述清楚，有个细节我不明白：
包含目的条带的PCR产物应该不止一条，是先把该PCR产物连接，转化，挑克隆，
然后菌液PCR挑选有条带（此处的条带应该大小不同）的菌液去测序找切割位点，然
后统计切割率？
还是PCR后把比较明亮的带都切下来分别胶回收，以回收后的产物去连接转化挑克隆，
从中挑选一定数量的白斑去测序，计算测到切割条带和其他情况的比率（包括假阳性）？
我觉得貌似第一种理解更合理，
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有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
25楼2014-02-26 16:26:08
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
傲雪清霜(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-08-15 12:59:02
引用回帖:
25楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-26 16:26:08
主条带是目的条带很亮，但是还有其他肉眼可见条带，华大测的，据说可以。
最后挑好的单克隆直接测序就好了吧？如果菌液PCR后测序貌似没多大意思？
之前的问题你回答的很详细，可能由于我没有表述清楚，有个细节我 ...

我也觉得第一种合理，不过我会照第二种去做...
为什么呢...先看个降解组数据吧。不了解降解组的话可以自己google一下，这里可以简单地理解为按照你所说的第一种方法做5'RACE，然后挑了成千上万个克隆去测序。然后在RNA上把各个位点检测到的克隆数标出，如下图（这是水稻中某个受mir393调控的基因，识别位点是2220附近）。
5‘Race验证miRNA靶点的原理
图中2220附近有一个峰，数值是196（图中未列出），意即有196个克隆检测到5'末端是2220这点。但假如你是在2500的地方的设计引物，那么2500之前所有点的总和是1029。就是说按照你说的第一种方法挑10个克隆测序，运气好可能会检测到两三个（平均196/1029个）目标位点的克隆，运气稍不好就检测不到目标克隆了。

这样的话你怎么解释实验结果呢（上文下划线部分）？是该认为该基因受mir393调控的证据比较弱？
但如果再看回降解组数据的图，其实受调控的证据是很强的。
所以我会按你说的第二种方法做咯。


按第二种方法的话，一开始是分别切下有希望的几条带，回收连T载体转化挑10个克隆测序。
后来发现有些条带是非特异性扩增，也有单引物扩增，有些条带并不对应我的目的位点。于是后来就先回收产物重复PCR，测序，排除不想要的。再挑那个目的条带回收连T载体转化挑10个克隆测序。
毕竟我只要说明这么多条带里面有一条是对应我的目的位点就可以了。
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26楼2014-02-26 21:21:33
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cfl88gupan

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据，就是说，要知道miRNA和（预测的）靶基因在你要研究的物种里的数据（这是显而易见的，否则根本没法设计引物）。

2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/p ...

这位大神，特愿请教您一个问题，我将材料送到公司（贝瑞和康）去测序了，得到了817个novel的序列以及mature的若干，关键在于这817个，我觉得数据太大了，很难相信啊，挑了四个做之后，一个也没有做成功，不知道后面该怎么下去，能否提供点意见啊  谢谢咯
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你还行的
27楼2014-03-08 16:10:35
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by cfl88gupan at 2014-03-08 16:10:35
这位大神，特愿请教您一个问题，我将材料送到公司（贝瑞和康）去测序了，得到了817个novel的序列以及mature的若干，关键在于这817个，我觉得数据太大了，很难相信啊，挑了四个做之后，一个也没有做成功，不知道后面 ...

大神不敢当，其实我也不是很懂的...而且估计以后也不做这个了
高通量测序什么的我没做过，也不太懂.
你所说的novel序列是指新发现的成熟microRNA序列吗？那么“mature若干”是什么意思？挑了4个做的是什么实验？怎么选的这4个？
水平有限，未必能帮到你。不介意的话希望你说详细点大家讨论讨论。
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28楼2014-03-08 19:35:16
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音四1990

铁虫 (小有名气)
我用过ROCHE和SUPERSWITCH的RACE Kit 但是都好贵 老师推荐我买的全式金的酶 那个比进口便宜跑出来效果也没差
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我没那种命啊轮也不会轮到我
29楼2014-03-09 09:33:31
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cfl88gupan

金虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-03-08 19:35:16
大神不敢当，其实我也不是很懂的...而且估计以后也不做这个了
高通量测序什么的我没做过，也不太懂.
你所说的novel序列是指新发现的成熟microRNA序列吗？那么“mature若干”是什么意思？挑了4个做的是什么实验？ ...

novel 是指新发现的microRNA序列，数据库里没有的，“mature若干”是指数据库里面有的有很多，挑了4个做了验证microRNA是否真的存在于我的材料里面的这个实验（公司给的结果假阳性很多的），选的时候条件是：是否与抗逆相关和片段数目（公司给的数据里面有）。高通量测序是指将材料交给公司，然后让他们进行microRNA全部的测序。不知道说明白否？
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你还行的
30楼2014-03-09 11:12:43
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