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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5‘Race验证miRNA靶点的原理
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
傲雪清霜(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-15 12:58:41
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30楼: Originally posted by cfl88gupan at 2014-03-09 11:12:43
novel 是指新发现的microRNA序列，数据库里没有的，“mature若干”是指数据库里面有的有很多，挑了4个做了验证microRNA是否真的存在于我的材料里面的这个实验（公司给的结果假阳性很多的），选的时候条件是：是否与 ...

明白了。
你的验证实验是做Northern吗？
会不会由于实验本身比较难做导致你没做出来？
加入实验的结果是可靠的，会不会因为实验本身敏感度较低，或者你的材料里microRNA丰度较低使你没有检测出？

假如你已经从测序数据里选了一个片段数目相当而且经过前人验证的miRNA作为验证实验的正对照，那么你的目标没检测出确实是个比较奇怪的结果。
这里我只想到两种解释：
验证实验用的材料与测序用的材料不一致；
测序结果不可靠，或者需要进一步筛选。
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31楼2014-03-09 12:34:04
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感谢真实

银虫 (初入文坛)
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20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

您好，您说的这个5‘RACE，两端引物分别是什么？我只知道RACE是扩全长用的，现在您和其他人都在讲的这个断裂位点，我很困惑。引物是5’的反向互补，另一条呢，来自预测的miRNA？？不是结合3‘-UTR么，为什么都要扩5’？希望大神能给俺答疑解惑，真心想的头大
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毕业了~实验继续
32楼2014-08-15 10:55:13
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
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32楼: Originally posted by 感谢真实 at 2014-08-15 10:55:13
您好，您说的这个5‘RACE，两端引物分别是什么？我只知道RACE是扩全长用的，现在您和其他人都在讲的这个断裂位点，我很困惑。引物是5’的反向互补，另一条呢，来自预测的miRNA？？不是结合3‘-UTR么，为什么都要扩 ...

首先，没什么能规定miRNA必须结合3' UTR。
然后，这里讨论的是那种通过切断靶标起作用的miRNA。
针对这种情况，我们通过检测候选靶标的预测结合位点是否出现大量断裂物来判断其是否受到miRNA的作用。
既然是断裂物，用RLM-RACE技术检测5'末端或者3'末端就能实现检测目的。
为什么要用5'RACE？据说5'断口比较稳定。
那么引物是怎么来的?一条来自接头序列，一条来自靶标RNA。你看看RLM-RACE的原理就明白了。
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33楼2014-08-15 21:21:45
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wlf200501

新虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-19 15:13:15
谢谢，确实如你所说，动物中很少用RACE的，我找到的文献大多是植物相关的，可能跟动物miRNA靶点较多有关。还有几个问题不是很明白，希望得到你的指点～

1.我在相应的转录组找到了miRNA与其靶点的结合处，上游正 ...

你好，不知道您现在race做的怎么样了，我做的是植物方向miRNA，老师要求做靶基因验证，准备花7000块 买只能用十次的 clontech的盒子。感觉压力大，网上都说不好做。想好好请教您一下，我也联系@XOooZzz了，但是还没回复我，相对比较着急，呵呵 所以。。。。希望理解。能加您一下QQ吗，或者您加我31789632
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34楼2014-12-16 18:27:01
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wlf200501

新虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

你好，您说smart—5‘race不适合miRNA靶基因验证，我刚想买clontech 的SMARTer® RACE 5’/3’ Kit盒子。是不是不太好，我做的是大豆材料的5‘race。之前对降解组进行了，t-plot分析。预测的应该没问题，剩下就是做验证了。麻烦您不吝赐教，谢谢了。
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35楼2014-12-23 10:04:15
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wenchaohee

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

说的太好了！赞！！
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36楼2015-01-25 12:45:04
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cold_blood

金虫 (小有名气)
需要做降解组测序吗？
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生活，不是看你有什么，而是看你要什么。
37楼2015-10-12 23:22:07
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koala0224

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建 ...

大侠，你好，我也是做验证靶基因位点，看文献好些都是ABI的试剂盒做的，那试剂盒要7500块，老板嫌贵了，而且我也是主要用到RNA接头，其余试剂暂时用不到，买了也不划算。我想着用试剂盒说明里给出的RNA接头序列让试剂公司来合成。我看你说你做验证也没有用试剂盒，那你用的RNA接头是自己合成的吗？这个接头合成有什么讲究吗？有什么结构上的要求吗？合成后直接用T4RNA连接酶连接就可以了吗？下面的是接头序列。先谢谢哦。
5' RACE Adapter (0.3 μg/μL)        5'-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3'
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38楼2016-05-21 09:28:57
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yantaowang

金虫 (正式写手)

奋斗小青年
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据，就是说，要知道miRNA和（预测的）靶基因在你要研究的物种里的数据（这是显而易见的，否则根本没法设计引物）。

2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/p ...

您好，我最近也在做5‘-Race，验证miRNA靶基因的切割位点，提取RNA后，加5’接头序列，用的是Takara的T4 RNA连接酶，过夜后反转录，得到cDNA。采用touch-Down PCR进行扩增，能够看到有条带，回收后发现是26 S rRNA序列，还有一个是我研究的物种的序列，但都不是目的序列，我想问一下，这样的结果是由于我的基因特异性引物2的特异性不强所导致的吗？我接下来是需要重新设计引物扩增，那该如何避免出现类似的情况，如果不是的话，我又该怎样改进我的实验呢。谢谢！
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我生命里的温暖就那么多......全部给了你！
39楼2016-12-30 13:40:46
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曲右将军

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据，就是说，要知道miRNA和（预测的）靶基因在你要研究的物种里的数据（这是显而易见的，否则根本没法设计引物）。

2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/p ...

求教！我的情况是基因启动子加上GUS，染色出来根里表达高，但是基因在根里表达特别低，怀疑是miRNA切割了，但是扩增不出来，请问我选择样品RNA时要考虑基因RNA的表达量吗？
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40楼2018-01-12 15:01:29
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