应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5‘Race验证miRNA靶点的原理
412/5返回列表上一页12345下一页
查看: 11540  |  回复: 40
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by Carnity at 2014-02-19 17:03:42
最近也在关注microRNA的做法，还没着手做，先收个贴，灌个水，以后整明白了别忘了教教我哈

共同学习~
回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
11楼2014-02-21 12:40:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 16:12:24
动物做RACE的少，是因为据说大部分情况下，动物microRNA对RNA进行翻译抑制，并不切断RNA，也就不能做RACE了。

1、我自己会选250～1000。为的是跑胶和PCR都比较方便。检验一般不做吧，设计引物的时候注意和上游引 ...

你好，又有个问题需要向你请教一下，你做的时候有没有对连接好接头的RNA进行变性处理，在进行后续试验啊？立体结构复杂的基因怎么定义的？谢谢~
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
12楼2014-02-21 16:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-21 16:40:22
你好，又有个问题需要向你请教一下，你做的时候有没有对连接好接头的RNA进行变性处理，在进行后续试验啊？立体结构复杂的基因怎么定义的？谢谢~...

RNA连好接头后直接按照逆转录酶的说明进行操作了。
你用试剂盒的话按试剂盒的做应该就可以了吧。逆转录前会有个高温处理步骤吧？
我也不知道立体结构复杂的基因怎么定义。也许你可以用RNAstructure等程序分析一下你的RNA有没有比较稳定的二级结构。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

傲雪清霜
13楼2014-02-21 18:15:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxn

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据，就是说，要知道miRNA和（预测的）靶基因在你要研究的物种里的数据（这是显而易见的，否则根本没法设计引物）。

2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/p ...

你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒，扩增的条带基本与自己预测到的是一致的，但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教
赞一下 回复此楼
14楼2014-02-23 16:13:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by zhangxn at 2014-02-23 16:13:23
你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒，扩增的条带基本与自己预测到的是一致的，但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教...

测序结果和你的目标基因完全对不上？是PCR产物直接测序？那就是非特异性扩增吧...
你的引物特异性好不好？做的是巢氏PCR吧？
赞一下 回复此楼
15楼2014-02-23 20:24:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by zhangxn at 2014-02-23 16:13:23
你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒，扩增的条带基本与自己预测到的是一致的，但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教...

你好，你有没有做去磷酸化和去接头那两步啊？我直接总RNA加接头，结果outer PCR除了引物二聚体，嘛都没有，今天又在做control了，看看是不是操作问题~
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
16楼2014-02-24 09:52:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-21 18:15:41
RNA连好接头后直接按照逆转录酶的说明进行操作了。
你用试剂盒的话按试剂盒的做应该就可以了吧。逆转录前会有个高温处理步骤吧？
我也不知道立体结构复杂的基因怎么定义。也许你可以用RNAstructure等程序分析一下 ...

你好，你验证靶标时有没有做去磷酸化和去接头那两步啊？我直接总RNA加接头，结果outer PCR除了引物二聚体，嘛都没有，今天又在做control了，不知道是操作问题还是模版问题~
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
17楼2014-02-24 11:25:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-24 11:25:03
你好，你验证靶标时有没有做去磷酸化和去接头那两步啊？我直接总RNA加接头，结果outer PCR除了引物二聚体，嘛都没有，今天又在做control了，不知道是操作问题还是模版问题~...

没有。第一轮PCR没有也正常，第二轮PCR有就好。最好每次都做1个正对照以防操作或者试剂有问题。

我做得比较粗放：
提总RNA
直接取1ug，加接头、酶等连接
直接取1uL连接物逆转录
直接取0.5uL逆转录物做PCR
赞一下 回复此楼
18楼2014-02-24 12:55:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲雪清霜

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 12:55:23
没有。第一轮PCR没有也正常，第二轮PCR有就好。最好每次都做1个正对照以防操作或者试剂有问题。

我做得比较粗放：
提总RNA
直接取1ug，加接头、酶等连接
直接取1uL连接物逆转录
直接取0.5uL逆转录物做PCR...

对哦，第一轮只跑了20个循环，表达量不高的话是看不到带的，第二轮有带了，都不太长，1000bp以下，切胶回收了，准备做连接。但是我搞不明白挑克隆怎么来说明靶标的某个位置是miRNA的切割位点，因为我们没有去磷酸化，那理论上包含目的靶标序列的片段应该有很多才对，而我们切出来的带应该是特定大小的DNA片段。参考文献上6/10这样的标志实际含义到底是什么啊？是直接挑白斑测序看有没有目的靶基因呢？还是包含完整靶标和不完整靶标的比例？我实在搞不明白这个原理，还有需不需要菌液PCR啊？谢谢～
赞一下 回复此楼
有时候我可以理解这个世界，有时候又什么都不懂~
19楼2014-02-25 13:09:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 回帖置顶 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代发): 金币+50, 楼主奖励 2014-02-25 17:35:55
引用回帖:
19楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-25 13:09:07
对哦，第一轮只跑了20个循环，表达量不高的话是看不到带的，第二轮有带了，都不太长，1000bp以下，切胶回收了，准备做连接。但是我搞不明白挑克隆怎么来说明靶标的某个位置是miRNA的切割位点，因为我们没有去磷酸化 ...

如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话，我一般先切胶回收，用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化，然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧：
这里不建议进行蓝白斑筛选。因为5'RACE片段一般较短且在编码区，该片段插入T载体后很可能（17 % ～ 100 %的概率）并不打断LacZ基因的ORF，因而蓝白斑筛选并无太大意义，反而可能使人选择性地避开蓝斑而漏检部分有效的片段。

然后是5'RACE的一些原理，水平有限，仅作参考：
生物体内RNA由于受RISC切割等原因，会断裂成截断的片段。若想对切割的位点进行检测，需要检测出“3'端断裂产物”的5'末端碱基序列，即可推测出切割位点，而这可以通过进行RLM-5'RACE实验实现。理论上对“5'端断裂产物”进行3'RACE能实现同样的目的，但因为RNA一般从3'端开始降解，故对更稳定的5'端进行RACE实验更为合适。
检测断裂位点的RLM-5'RACE实验步骤比检测全长的5'RACE简单，简述如下：提取RNA，给RNA连上人工接头，按常规流程进行逆转录，根据接头序列及目标RNA的已知序列合成引物对逆转录产物进行PCR，PCR产物送测序，分析测序结果。
其中有以下细节需要了解：
接头是否能顺利连接？如何防止接头的自连？RNA被RISC切割后，断裂形成的5'端带有Pi-基团，因此可以在RNA Ligase的作用下与人工合成的RNA接头（单链RNA短片段）连接。人工合成的RNA接头由于两端都是OH-基团，不会发生自连，也不会与RNA的3'端连接。而且由于添加的RNA接头是过量的，因此RNA断裂片段间的连接可以忽略。综上，可以保证连接产物绝大部分为“RNA接头--断裂的RNA片段”。
RNA接头如何设计？接头的设计并未找到什么指导原则，有兴趣可以再翻翻文献。但已知有以下几点：商业化试剂盒里的接头很少会形成发夹环或者二聚体结构，为保险起见自行设计时也应避免形成二级结构。接头3'端应以AAA结尾，因为据文献报道3'端为A能提高连接效率，连续三个A能保证即使接头由于降解或合成缺陷而缺失一两个碱基，末尾仍然是A。RNA接头可以尽量长，以便在其上设计引物，但一般公司似乎只能合成45 nt，这也可以满足实验要求。
SMART-5'RACE并不适用于本实验，因为该技术对断裂的RNA片段不敏感，具体原因可以参看SMART RACE的说明书。至于其它RACE技术是否适用，需具体情况具体分析。

为什么5'RACE能说明miRNA对靶标RNA的切割？
体内RNA由于各种原因，常会在不同位点断成长短不同的片段。假如一个RNA没受到什么位点特异的机制对其降解，那么我们如果对其进行5'RACE，可以很合理地推测会检测到很多不同大小的片段，而且这些片段的亮度应该都差不多。
但假如我们做完5'RACE以后发现，某个长度的片段（对应RNA某个位点的断开事件）特别亮，那么我们就可以很合理地推测这个RNA似乎是受到某种位点特异的降解机制调控的。
假如幸运地发现，那个特别容易断开的位点正好被预测是能与miRNA结合的，那么我们就可以很有把握地推测这个位点的断开事件其实都是这个miRNA的功劳。

呃.....不过有意找茬的时候也可以说这只是巧合：
假如一条RNA 2000 nt；
假如在那上面预测到一个miRNA的结合位点；
假如由于随机和巧合的原因，任意一条RNA上总有那么1~2个位点相对而言特别容易断开；
那么这个特别容易断开的位点正好位于预测的miRNA结合位点中间2个碱基上时的概率是1/（2000/2/2）=0.2%
这个概率不算大，但也并非完全没有可能。
赞一下(12人) 回复此楼
20楼2014-02-25 16:34:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 傲雪清霜 的主题更新
412/5返回列表上一页12345下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭