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傲雪清霜

银虫 (小有名气)

送红花一朵
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10楼: Originally posted by Carnity at 2014-02-19 17:03:42
最近也在关注microRNA的做法,还没着手做,先收个贴,灌个水,以后整明白了别忘了教教我哈

共同学习~
有时候我可以理解这个世界,有时候又什么都不懂~
11楼2014-02-21 12:40:25
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)

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8楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 16:12:24
动物做RACE的少,是因为据说大部分情况下,动物microRNA对RNA进行翻译抑制,并不切断RNA,也就不能做RACE了。

1、我自己会选250~1000。为的是跑胶和PCR都比较方便。检验一般不做吧,设计引物的时候注意和上游引 ...

你好,又有个问题需要向你请教一下,你做的时候有没有对连接好接头的RNA进行变性处理,在进行后续试验啊?立体结构复杂的基因怎么定义的?谢谢~
有时候我可以理解这个世界,有时候又什么都不懂~
12楼2014-02-21 16:40:22
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

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12楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-21 16:40:22
你好,又有个问题需要向你请教一下,你做的时候有没有对连接好接头的RNA进行变性处理,在进行后续试验啊?立体结构复杂的基因怎么定义的?谢谢~...

RNA连好接头后直接按照逆转录酶的说明进行操作了。
你用试剂盒的话按试剂盒的做应该就可以了吧。逆转录前会有个高温处理步骤吧?
我也不知道立体结构复杂的基因怎么定义。也许你可以用RNAstructure等程序分析一下你的RNA有没有比较稳定的二级结构。

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13楼2014-02-21 18:15:41
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zhangxn

铜虫 (小有名气)

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6楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因组数据无所谓。但要有RNA数据,就是说,要知道miRNA和(预测的)靶基因在你要研究的物种里的数据(这是显而易见的,否则根本没法设计引物)。

2、用预测软件。植物的我用这个http://plantgrn.noble.org/p ...

你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒,扩增的条带基本与自己预测到的是一致的,但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教
14楼2014-02-23 16:13:23
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

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14楼: Originally posted by zhangxn at 2014-02-23 16:13:23
你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒,扩增的条带基本与自己预测到的是一致的,但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教...

测序结果和你的目标基因完全对不上?是PCR产物直接测序?那就是非特异性扩增吧...
你的引物特异性好不好?做的是巢氏PCR吧?
15楼2014-02-23 20:24:44
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)

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14楼: Originally posted by zhangxn at 2014-02-23 16:13:23
你好 最近在做植物miRNA的5'RACE  用的是TAKARA的试剂盒,扩增的条带基本与自己预测到的是一致的,但测序的结果与预测的结果根本比不上 是怎么回事啊    请高手赐教...

你好,你有没有做去磷酸化和去接头那两步啊?我直接总RNA加接头,结果outer PCR除了引物二聚体,嘛都没有,今天又在做control了,看看是不是操作问题~
有时候我可以理解这个世界,有时候又什么都不懂~
16楼2014-02-24 09:52:50
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)

送红花一朵
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13楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-21 18:15:41
RNA连好接头后直接按照逆转录酶的说明进行操作了。
你用试剂盒的话按试剂盒的做应该就可以了吧。逆转录前会有个高温处理步骤吧?
我也不知道立体结构复杂的基因怎么定义。也许你可以用RNAstructure等程序分析一下 ...

你好,你验证靶标时有没有做去磷酸化和去接头那两步啊?我直接总RNA加接头,结果outer PCR除了引物二聚体,嘛都没有,今天又在做control了,不知道是操作问题还是模版问题~
有时候我可以理解这个世界,有时候又什么都不懂~
17楼2014-02-24 11:25:03
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

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17楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-24 11:25:03
你好,你验证靶标时有没有做去磷酸化和去接头那两步啊?我直接总RNA加接头,结果outer PCR除了引物二聚体,嘛都没有,今天又在做control了,不知道是操作问题还是模版问题~...

没有。第一轮PCR没有也正常,第二轮PCR有就好。最好每次都做1个正对照以防操作或者试剂有问题。

我做得比较粗放:
提总RNA
直接取1ug,加接头、酶等连接
直接取1uL连接物逆转录
直接取0.5uL逆转录物做PCR
18楼2014-02-24 12:55:23
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傲雪清霜

银虫 (小有名气)

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18楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 12:55:23
没有。第一轮PCR没有也正常,第二轮PCR有就好。最好每次都做1个正对照以防操作或者试剂有问题。

我做得比较粗放:
提总RNA
直接取1ug,加接头、酶等连接
直接取1uL连接物逆转录
直接取0.5uL逆转录物做PCR...

对哦,第一轮只跑了20个循环,表达量不高的话是看不到带的,第二轮有带了,都不太长,1000bp以下,切胶回收了,准备做连接。但是我搞不明白挑克隆怎么来说明靶标的某个位置是miRNA的切割位点,因为我们没有去磷酸化,那理论上包含目的靶标序列的片段应该有很多才对,而我们切出来的带应该是特定大小的DNA片段。参考文献上6/10这样的标志实际含义到底是什么啊?是直接挑白斑测序看有没有目的靶基因呢?还是包含完整靶标和不完整靶标的比例?我实在搞不明白这个原理,还有需不需要菌液PCR啊?谢谢~
有时候我可以理解这个世界,有时候又什么都不懂~
19楼2014-02-25 13:09:07
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

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silicare: 回帖置顶 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代发): 金币+50, 楼主奖励 2014-02-25 17:35:55
引用回帖:
19楼: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-25 13:09:07
对哦,第一轮只跑了20个循环,表达量不高的话是看不到带的,第二轮有带了,都不太长,1000bp以下,切胶回收了,准备做连接。但是我搞不明白挑克隆怎么来说明靶标的某个位置是miRNA的切割位点,因为我们没有去磷酸化 ...

如果条带很多又分不清哪个是目标条带的话,我一般先切胶回收,用回收物重做一次PCR然后送去测序。看看哪个条带测序结果与实验预期相符再做转化,然后挑10个克隆再测序。
我翻翻以前的文字....贴下面吧:
这里不建议进行蓝白斑筛选。因为5'RACE片段一般较短且在编码区,该片段插入T载体后很可能(17 % ~ 100 %的概率)并不打断LacZ基因的ORF,因而蓝白斑筛选并无太大意义,反而可能使人选择性地避开蓝斑而漏检部分有效的片段。

然后是5'RACE的一些原理,水平有限,仅作参考:
生物体内RNA由于受RISC切割等原因,会断裂成截断的片段。若想对切割的位点进行检测,需要检测出“3'端断裂产物”的5'末端碱基序列,即可推测出切割位点,而这可以通过进行RLM-5'RACE实验实现。理论上对“5'端断裂产物”进行3'RACE能实现同样的目的,但因为RNA一般从3'端开始降解,故对更稳定的5'端进行RACE实验更为合适。
检测断裂位点的RLM-5'RACE实验步骤比检测全长的5'RACE简单,简述如下:提取RNA,给RNA连上人工接头,按常规流程进行逆转录,根据接头序列及目标RNA的已知序列合成引物对逆转录产物进行PCR,PCR产物送测序,分析测序结果。
其中有以下细节需要了解:
接头是否能顺利连接?如何防止接头的自连?RNA被RISC切割后,断裂形成的5'端带有Pi-基团,因此可以在RNA Ligase的作用下与人工合成的RNA接头(单链RNA短片段)连接。人工合成的RNA接头由于两端都是OH-基团,不会发生自连,也不会与RNA的3'端连接。而且由于添加的RNA接头是过量的,因此RNA断裂片段间的连接可以忽略。综上,可以保证连接产物绝大部分为“RNA接头--断裂的RNA片段”。
RNA接头如何设计?接头的设计并未找到什么指导原则,有兴趣可以再翻翻文献。但已知有以下几点:商业化试剂盒里的接头很少会形成发夹环或者二聚体结构,为保险起见自行设计时也应避免形成二级结构。接头3'端应以AAA结尾,因为据文献报道3'端为A能提高连接效率,连续三个A能保证即使接头由于降解或合成缺陷而缺失一两个碱基,末尾仍然是A。RNA接头可以尽量长,以便在其上设计引物,但一般公司似乎只能合成45 nt,这也可以满足实验要求。
SMART-5'RACE并不适用于本实验,因为该技术对断裂的RNA片段不敏感,具体原因可以参看SMART RACE的说明书。至于其它RACE技术是否适用,需具体情况具体分析。

为什么5'RACE能说明miRNA对靶标RNA的切割?
体内RNA由于各种原因,常会在不同位点断成长短不同的片段。假如一个RNA没受到什么位点特异的机制对其降解,那么我们如果对其进行5'RACE,可以很合理地推测会检测到很多不同大小的片段,而且这些片段的亮度应该都差不多。
但假如我们做完5'RACE以后发现,某个长度的片段(对应RNA某个位点的断开事件)特别亮,那么我们就可以很合理地推测这个RNA似乎是受到某种位点特异的降解机制调控的。
假如幸运地发现,那个特别容易断开的位点正好被预测是能与miRNA结合的,那么我们就可以很有把握地推测这个位点的断开事件其实都是这个miRNA的功劳。

呃.....不过有意找茬的时候也可以说这只是巧合:
假如一条RNA 2000 nt;
假如在那上面预测到一个miRNA的结合位点;
假如由于随机和巧合的原因,任意一条RNA上总有那么1~2个位点相对而言特别容易断开;
那么这个特别容易断开的位点正好位于预测的miRNA结合位点中间2个碱基上时的概率是1/(2000/2/2)=0.2%
这个概率不算大,但也并非完全没有可能。
20楼2014-02-25 16:34:08
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