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菜菜0929

木虫 (小有名气)

[交流] 急！！求助primer5使用问题

请问1、输入primer5的序列必须是5‘到3’还是3‘到5’？
       2、设计引物时，*G的要求是什么？
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1楼 2014-01-17 18:16:20
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菜菜0929

木虫 (小有名气)
怎么没有人
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2楼2014-01-17 19:30:42
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-21 09:29:34
输入primer5的序列没有很严格的要求，只要能设计出来就行。
设计引物时，C  G的要求是40%-60%。但是实在多了超过60%也没事。
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3楼2014-01-18 11:34:05
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菜菜0929

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-01-18 11:34:05
输入primer5的序列没有很严格的要求，只要能设计出来就行。
设计引物时，C  G的要求是40%-60%。但是实在多了超过60%也没事。

嗯，^G值有什么要求，上下引物要差不多？差的多影响大吗？

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4楼2014-01-19 21:29:30
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 菜菜0929 at 2014-01-19 21:29:30
嗯，^G值有什么要求，上下引物要差不多？差的多影响大吗？
...

我师姐设计引物一般只看GC%，退火温度，发夹结构，引物二聚体，错配，长度这几方面。
赞一下 回复此楼
5楼2014-01-20 08:51:11
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菜菜0929

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-01-20 08:51:11
我师姐设计引物一般只看GC%，退火温度，发夹结构，引物二聚体，错配，长度这几方面。...

(⊙o⊙)哦，谢谢

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6楼2014-01-20 18:31:54
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寂寞又美好

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-01-21 09:29:39
一般从NCBI中下载得到的序列都是5‘到3’的，直接输入到Primer里面就行了，关于primer5设计引物，荧光引物和普通引物还是有很大的差别的，荧光引物最好所有的评分都是100,这样一般送一对合成足以，如果是普通引物要求就可以放松了，首先考虑的是错配，当然如果错配发生在非扩增区域就不用管，然后看自身二聚体，交叉二聚体，像这种ΔG的绝对值最好小于4.5左右，当然万一不行也可以放大，一般来讲，所有的参数ΔG控制在10以内。有时候引物设计出来即使是评分是100效果也不一定很好，因为如果你看一下Report选项中的Internal stability 就会发先你的上游或者下游引物的能量曲线可能有一个不是正弦曲线，一个好的引物不仅要从评分来看，还要从能势上考虑，理想的引物其能势呈正弦曲线，能势越高退火时越容易和模板结合，因此好的引物5‘端能势相对较高，3’端相对来说较低。
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7楼2014-01-20 22:05:25
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