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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 正反向测序问题
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nnbj

新虫 (初入文坛)

[求助] 正反向测序问题 已有1人参与

本人最近将一外源片段和质粒利用EcoRV与MluI酶切后连接，挑去单克隆进行测序。分别设计正反向引物，反向引物测序结果显示目的基因后半部分正确，正向引物测序结果很乱（发现将正向引物测序结果和反向测序结果align后，这两个测序序列基本相同，将两个序列结果assemble测序显示目的基因后半部分正确，故得不到前半部分结果）。第一次怀疑引物设计出现问题，第二次利用T7通用引物再次正向测，结果同第一次。不知道问题出现在了哪里？
求高手指教。

[ Last edited by nnbj on 2014-1-3 at 20:11 ]
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1楼 2014-01-03 19:37:23
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nnbj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-04 04:03:16
测序通常采用载体上的通用引物。用自己设计的目的基因特异引物会有一小段靠近引物的序列测不出来。
如果你克隆的片段小于700bp，完全可以用一个反应测，随便哪个方向都可以的。如果克隆片段在700-1400bp之间，需要 ...

这个我知道的，问题出现在了测序部分。
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3楼2014-01-05 21:52:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-06 09:51:53
测序通常采用载体上的通用引物。用自己设计的目的基因特异引物会有一小段靠近引物的序列测不出来。
如果你克隆的片段小于700bp，完全可以用一个反应测，随便哪个方向都可以的。如果克隆片段在700-1400bp之间，需要用正反向引物才能测通。如果比1400bp大，需要在中间设计基因特异引物。
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2楼2014-01-04 04:03:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nnbj at 2014-01-05 21:52:40
这个我知道的，问题出现在了测序部分。...

多送几个克隆去测，有时候模板质量不好也会有问题。
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4楼2014-01-06 01:23:54
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永恒_99

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-04 04:03:16
测序通常采用载体上的通用引物。用自己设计的目的基因特异引物会有一小段靠近引物的序列测不出来。
如果你克隆的片段小于700bp，完全可以用一个反应测，随便哪个方向都可以的。如果克隆片段在700-1400bp之间，需要 ...

您好，想问一下，刚开始使用自己的引物正向测序，结果有几个碱基发生突变，有一个样品突变较多。第二次使用通用引物反向测序后结果很好，没有突变。那说明我的结果可以正常使用吗，还是需要做其他的。谢谢。
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5楼2015-04-30 15:35:35
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