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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同种，不同型号的大肠杆菌P出来目的基因的可能性多大？
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嗰叽嗰叽

金虫 (小有名气)

[求助] 同种，不同型号的大肠杆菌P出来目的基因的可能性多大？ 已有1人参与

想克隆A大肠杆菌的某基因，已证实该型号A存在该基因，但是现在我想尝试从别的B型号的大肠杆菌尝试看看能不能P出目的基因，哪怕是特异性弱的，求前辈们指点下，有必要做吗？
或者求科普下相关的基本知识，小弟新手
如下是做的菌液PCR的B大肠杆菌，什么都没出现
同种，不同型号的大肠杆菌P出来目的基因的可能性多大？
2013.12.31DH5a.jpg
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Wearehereandwearewating.
1楼 2014-01-01 19:35:00
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koko8001

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
嗰叽嗰叽: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2014-01-01 21:08:33
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-02 08:34:45
我之前也做过类似的事情，一开始一直失败，后来将引物设计长一点，退火温度提高点，然后一开始的变性时间可以加长点（先煮沸10分钟，然后PCR时一开始的变性再加个好几分钟），循环次数增加到45次甚至更多，试了几次就P出来了
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2楼2014-01-01 19:57:02
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嗰叽嗰叽

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by koko8001 at 2014-01-01 19:57:02
我之前也做过类似的事情，一开始一直失败，后来将引物设计长一点，退火温度提高点，然后一开始的变性时间可以加长点（先煮沸10分钟，然后PCR时一开始的变性再加个好几分钟），循环次数增加到45次甚至更多，试了几次 ...

请问你设计引物是多少BP？变性时间是多长呢？
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Wearehereandwearewating.
3楼2014-01-01 21:08:23
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koko8001

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 嗰叽嗰叽 at 2014-01-01 21:08:23
请问你设计引物是多少BP？变性时间是多长呢？...

引物长度25以上吧，30不到，TM较高了，P的时候退火温度高点，可以60出头，提高特异性，不然会P出很多猎奇的条带。
变性的话，我成功的那次，一开始的变性是6分钟还是7分钟，具体记不太清楚了，可以适当延长点。
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4楼2014-01-02 10:51:51
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