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嗰叽嗰叽

金虫 (小有名气)

[求助] 同种,不同型号的大肠杆菌P出来目的基因的可能性多大? 已有1人参与

想克隆A大肠杆菌的某基因,已证实该型号A存在该基因,但是现在我想尝试从别的B型号的大肠杆菌尝试看看能不能P出目的基因,哪怕是特异性弱的,求前辈们指点下,有必要做吗?
或者求科普下相关的基本知识,小弟新手
如下是做的菌液PCR的B大肠杆菌,什么都没出现
同种,不同型号的大肠杆菌P出来目的基因的可能性多大?
2013.12.31DH5a.jpg
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Wearehereandwearewating.
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koko8001

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
嗰叽嗰叽: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2014-01-01 21:08:33
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-02 08:34:45
我之前也做过类似的事情,一开始一直失败,后来将引物设计长一点,退火温度提高点,然后一开始的变性时间可以加长点(先煮沸10分钟,然后PCR时一开始的变性再加个好几分钟),循环次数增加到45次甚至更多,试了几次就P出来了
2楼2014-01-01 19:57:02
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嗰叽嗰叽

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by koko8001 at 2014-01-01 19:57:02
我之前也做过类似的事情,一开始一直失败,后来将引物设计长一点,退火温度提高点,然后一开始的变性时间可以加长点(先煮沸10分钟,然后PCR时一开始的变性再加个好几分钟),循环次数增加到45次甚至更多,试了几次 ...

请问你设计引物是多少BP?变性时间是多长呢?
Wearehereandwearewating.
3楼2014-01-01 21:08:23
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koko8001

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 嗰叽嗰叽 at 2014-01-01 21:08:23
请问你设计引物是多少BP?变性时间是多长呢?...

引物长度25以上吧,30不到,TM较高了,P的时候退火温度高点,可以60出头,提高特异性,不然会P出很多猎奇的条带。
变性的话,我成功的那次,一开始的变性是6分钟还是7分钟,具体记不太清楚了,可以适当延长点。
4楼2014-01-02 10:51:51
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