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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于点突变
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于点突变 已有3人参与

各位大虾，求助如下：
       以各位大虾做点突变的经验，ORF框内除了target site突变，其它位置也有突变，这个一般是什么原因造成的？我用的是Takara的点突变试剂盒，目的片段在T载体上，总长3000多bp，在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基，这是为什么？谢谢啦
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
1楼 2013-12-26 08:46:56
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-26 15:44:22
weiyuanzheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-27 21:15:38
takara的点突变试剂盒没用过。。但是里面肯定会有PCR的步骤，你确认下你PCR的时候用的什么Taq酶？如果是rTaq的话P3000多的条带延伸至少3分钟以上，如果30个循环的话至少也要P个2——3个小时，循环到后期Taq酶的活性都不行了，突变概率自然成倍提高~~如果你想上T载体的话，可以把试剂盒里的rTaq（或者LATaq）换成ExTaq，或者直接用高保真的系列PCR完再向体系中加点rTaq和dNTP72度处理5分钟给PCR产物加尾
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大家相互帮助哈
5楼2013-12-26 15:23:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:47
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图，重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读，人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外，你多送几个克隆去测序。
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2楼2013-12-26 11:13:24
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只要进行PCR就有突变的可能，可以优化一下你的PCR反应，比如稍增加模板的量，降低循环，或者使用试剂盒提供以外的高保真酶做PCR
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-12-26 14:53:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-27 21:10:46
谢谢，还想请问一下您用的高保真酶，是试剂盒配的呢，还是另外用其它的，比如Takara的primer STAR？...

酶最好用盒子给配的。其它高保真酶也可以用，不过酶作用条件和缓冲液体系可能不完全相同。
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10楼2013-12-28 00:14:23
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-30 12:50:51
哦，谢谢啦，那用TE buffer一般的PCR，酶切什么的应该都不会有影响吧？什么情况下才会影响后续试验操作呢？...

PCR完一般都有回收的步骤，比如说割胶回收或者纯化，经过纯化后的做酶切一类的绝对没问题，PCR完就酶切的不知道行不行，因为我从来没这样做过~~至少体系里残留的buffer和taq酶，对内切酶绝对会有影响的
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大家相互帮助哈
17楼2013-12-30 13:07:51
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:58
其它位置发生突变当然有可能，任何PCR都有可能造成突变。主要是DNA聚合酶错配碱基造成的问题。
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3楼2013-12-26 11:15:41
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-26 11:15:41
其它位置发生突变当然有可能，任何PCR都有可能造成突变。主要是DNA聚合酶错配碱基造成的问题。

谢谢，还想请问一下您用的高保真酶，是试剂盒配的呢，还是另外用其它的，比如Takara的primer STAR？
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6楼2013-12-27 21:10:46
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 15:23:52
takara的点突变试剂盒没用过。。但是里面肯定会有PCR的步骤，你确认下你PCR的时候用的什么Taq酶？如果是rTaq的话P3000多的条带延伸至少3分钟以上，如果30个循环的话至少也要P个2——3个小时，循环到后期Taq酶的活性 ...

我用的是试剂盒里面的Pyrobest DNA polymerase 对照用的是takara的primer STAR，感觉差别不是很大。另外是循环数30，用primer STAR的话扩增时间会很短。谢谢大虾，我再试试！
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
7楼2013-12-27 21:15:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-27 21:15:10
我用的是试剂盒里面的Pyrobest DNA polymerase 对照用的是takara的primer STAR，感觉差别不是很大。另外是循环数30，用primer STAR的话扩增时间会很短。谢谢大虾，我再试试！...

primeSTAR系列的保真度非常高，扩增时间也短，从我的样品测序经验来说，这个酶没问题~~点突变试剂盒里的那个酶从名字上来看保真度肯定不会差~用那个Pyrobest酶P出来可以上T载体吗？还有你如果做点突变的话，循环数还是25个循环比较保险~，
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8楼2013-12-27 23:15:06
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-27 21:15:10
我用的是试剂盒里面的Pyrobest DNA polymerase 对照用的是takara的primer STAR，感觉差别不是很大。另外是循环数30，用primer STAR的话扩增时间会很短。谢谢大虾，我再试试！...

还有你在你定点突变位置外其余的突变都在哪，离你的突变位置近吗，在不在你设计的引物里~？？
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9楼2013-12-27 23:36:55
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