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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于点突变
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-27 23:15:06
primeSTAR系列的保真度非常高，扩增时间也短，从我的样品测序经验来说，这个酶没问题~~点突变试剂盒里的那个酶从名字上来看保真度肯定不会差~用那个Pyrobest酶P出来可以上T载体吗？还有你如果做点突变的话，循环数 ...

嗯，谢谢大虾，我今天已经拿到了target site突变的菌株，非常感谢，以后还要多请教哈！
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
11楼2013-12-28 12:08:17
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
内容已删除
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
12楼2013-12-28 12:11:19
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-26 11:13:24
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图，重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读，人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外，你多送几个克隆去测序。

嗯，我仔细检查了一下测序峰，其实测序结果非常好，非常单一没有重叠，感觉不大像是测序的结果，不过还是谢谢您的提醒！
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
13楼2013-12-28 12:15:24
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-28 00:14:23
酶最好用盒子给配的。其它高保真酶也可以用，不过酶作用条件和缓冲液体系可能不完全相同。...

谢谢您，多谢提醒！
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
14楼2013-12-28 12:16:13
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:08:43
引用回帖:
12楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-28 12:11:19
离我点突变的位置很近，总是TTT处少一个T，不会是我引物设计的问题吧？但是今天我也拿到了一个比较满意的目的菌株，我以后应该引物设计注意点什么呢？主要是我在突变位点设计引物，突变位点尽可能的靠近primer F中 ...

1.首先一般公司设计的引物都存在一个纯度的问题，打个比方说，假如公司合成了100个引物，可能95个和你设计的序列一致，有5个不一致，本来合成DNA的准确度就不如测序高，哪个公司都不会保证合成的引物是100%的纯度。
2.你溶解引物的过程中出现了问题，一般溶解引物无论哪个手册都是推荐TE buffer溶解~，如果想省事用Q水溶解，稀释完不知道多分装几管，拿着一管引物反复冻融使用的话，这样在引物里丢片段的现象非常容易发生！
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大家相互帮助哈
15楼2013-12-28 14:49:00
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-28 14:49:00
1.首先一般公司设计的引物都存在一个纯度的问题，打个比方说，假如公司合成了100个引物，可能95个和你设计的序列一致，有5个不一致，本来合成DNA的准确度就不如测序高，哪个公司都不会保证合成的引物是100%的纯度。 ...

哦，谢谢啦，那用TE buffer一般的PCR，酶切什么的应该都不会有影响吧？什么情况下才会影响后续试验操作呢？
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
16楼2013-12-30 12:50:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-30 12:50:51
哦，谢谢啦，那用TE buffer一般的PCR，酶切什么的应该都不会有影响吧？什么情况下才会影响后续试验操作呢？...

PCR完一般都有回收的步骤，比如说割胶回收或者纯化，经过纯化后的做酶切一类的绝对没问题，PCR完就酶切的不知道行不行，因为我从来没这样做过~~至少体系里残留的buffer和taq酶，对内切酶绝对会有影响的
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大家相互帮助哈
17楼2013-12-30 13:07:51
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-30 13:07:51
PCR完一般都有回收的步骤，比如说割胶回收或者纯化，经过纯化后的做酶切一类的绝对没问题，PCR完就酶切的不知道行不行，因为我从来没这样做过~~至少体系里残留的buffer和taq酶，对内切酶绝对会有影响的...

谢谢啦
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
18楼2013-12-31 16:24:29
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sd3824289

木虫 (正式写手)
如果问题很多可以直接送去合成！这些问题我也出现过，如果出现非目的突变要看一下编码的蛋白质有没有发生变化，如果变化了，就得重新来！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
19楼2013-12-31 17:09:28
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