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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于点突变
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于点突变 已有3人参与

各位大虾，求助如下：
       以各位大虾做点突变的经验，ORF框内除了target site突变，其它位置也有突变，这个一般是什么原因造成的？我用的是Takara的点突变试剂盒，目的片段在T载体上，总长3000多bp，在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基，这是为什么？谢谢啦
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
1楼 2013-12-26 08:46:56
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:08:43
引用回帖:
12楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-28 12:11:19
离我点突变的位置很近，总是TTT处少一个T，不会是我引物设计的问题吧？但是今天我也拿到了一个比较满意的目的菌株，我以后应该引物设计注意点什么呢？主要是我在突变位点设计引物，突变位点尽可能的靠近primer F中 ...

1.首先一般公司设计的引物都存在一个纯度的问题，打个比方说，假如公司合成了100个引物，可能95个和你设计的序列一致，有5个不一致，本来合成DNA的准确度就不如测序高，哪个公司都不会保证合成的引物是100%的纯度。
2.你溶解引物的过程中出现了问题，一般溶解引物无论哪个手册都是推荐TE buffer溶解~，如果想省事用Q水溶解，稀释完不知道多分装几管，拿着一管引物反复冻融使用的话，这样在引物里丢片段的现象非常容易发生！
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大家相互帮助哈
15楼2013-12-28 14:49:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:47
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图，重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读，人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外，你多送几个克隆去测序。
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2楼2013-12-26 11:13:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:58
其它位置发生突变当然有可能，任何PCR都有可能造成突变。主要是DNA聚合酶错配碱基造成的问题。
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3楼2013-12-26 11:15:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只要进行PCR就有突变的可能，可以优化一下你的PCR反应，比如稍增加模板的量，降低循环，或者使用试剂盒提供以外的高保真酶做PCR
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-12-26 14:53:35
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