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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于点突变 已有3人参与

各位大虾,求助如下:
       以各位大虾做点突变的经验,ORF框内除了target site突变,其它位置也有突变,这个一般是什么原因造成的?我用的是Takara的点突变试剂盒,目的片段在T载体上,总长3000多bp,在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基,这是为什么?谢谢啦
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没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
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luwei13566

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-28 21:08:43
引用回帖:
12楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-28 12:11:19
离我点突变的位置很近,总是TTT处少一个T,不会是我引物设计的问题吧?但是今天我也拿到了一个比较满意的目的菌株,我以后应该引物设计注意点什么呢?主要是我在突变位点设计引物,突变位点尽可能的靠近primer F中 ...

1.首先一般公司设计的引物都存在一个纯度的问题,打个比方说,假如公司合成了100个引物,可能95个和你设计的序列一致,有5个不一致,本来合成DNA的准确度就不如测序高,哪个公司都不会保证合成的引物是100%的纯度。
2.你溶解引物的过程中出现了问题,一般溶解引物无论哪个手册都是推荐TE buffer溶解~,如果想省事用Q水溶解,稀释完不知道多分装几管,拿着一管引物反复冻融使用的话,这样在引物里丢片段的现象非常容易发生!
大家相互帮助哈
15楼2013-12-28 14:49:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:47
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图,重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读,人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外,你多送几个克隆去测序。
2楼2013-12-26 11:13:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:58
其它位置发生突变当然有可能,任何PCR都有可能造成突变。主要是DNA聚合酶错配碱基造成的问题。
3楼2013-12-26 11:15:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
只要进行PCR就有突变的可能,可以优化一下你的PCR反应,比如稍增加模板的量,降低循环,或者使用试剂盒提供以外的高保真酶做PCR
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-12-26 14:53:35
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