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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

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[求助] 关于点突变已有3人参与

各位大虾，求助如下：
以各位大虾做点突变的经验，ORF框内除了target site突变，其它位置也有突变，这个一般是什么原因造成的？我用的是Takara的点突变试剂盒，目的片段在T载体上，总长3000多bp，在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基，这是为什么？谢谢啦

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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。

1楼 2013-12-26 08:46:56

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:08:43

引用回帖:

12楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2013-12-28 12:11:19
离我点突变的位置很近，总是TTT处少一个T，不会是我引物设计的问题吧？但是今天我也拿到了一个比较满意的目的菌株，我以后应该引物设计注意点什么呢？主要是我在突变位点设计引物，突变位点尽可能的靠近primer F中 ...

1.首先一般公司设计的引物都存在一个纯度的问题，打个比方说，假如公司合成了100个引物，可能95个和你设计的序列一致，有5个不一致，本来合成DNA的准确度就不如测序高，哪个公司都不会保证合成的引物是100%的纯度。
2.你溶解引物的过程中出现了问题，一般溶解引物无论哪个手册都是推荐TE buffer溶解~，如果想省事用Q水溶解，稀释完不知道多分装几管，拿着一管引物反复冻融使用的话，这样在引物里丢片段的现象非常容易发生！