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weiyuanzheng铜虫 (小有名气)
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[求助]
关于点突变 已有3人参与
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各位大虾，求助如下： 以各位大虾做点突变的经验，ORF框内除了target site突变，其它位置也有突变，这个一般是什么原因造成的？我用的是Takara的点突变试剂盒，目的片段在T载体上，总长3000多bp，在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基，这是为什么？谢谢啦 |
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gyesang
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3楼2013-12-26 11:15:41
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weiyuanzheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-27 21:15:38
| takara的点突变试剂盒没用过。。但是里面肯定会有PCR的步骤，你确认下你PCR的时候用的什么Taq酶？如果是rTaq的话P3000多的条带延伸至少3分钟以上，如果30个循环的话至少也要P个2——3个小时，循环到后期Taq酶的活性都不行了，突变概率自然成倍提高~~如果你想上T载体的话，可以把试剂盒里的rTaq（或者LATaq）换成ExTaq，或者直接用高保真的系列PCR完再向体系中加点rTaq和dNTP72度处理5分钟给PCR产物加尾 |
5楼2013-12-26 15:23:52
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