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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于点突变
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于点突变 已有3人参与

各位大虾，求助如下：
       以各位大虾做点突变的经验，ORF框内除了target site突变，其它位置也有突变，这个一般是什么原因造成的？我用的是Takara的点突变试剂盒，目的片段在T载体上，总长3000多bp，在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基，这是为什么？谢谢啦
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
1楼 2013-12-26 08:46:56
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-26 15:44:22
weiyuanzheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-27 21:15:38
takara的点突变试剂盒没用过。。但是里面肯定会有PCR的步骤，你确认下你PCR的时候用的什么Taq酶？如果是rTaq的话P3000多的条带延伸至少3分钟以上，如果30个循环的话至少也要P个2——3个小时，循环到后期Taq酶的活性都不行了，突变概率自然成倍提高~~如果你想上T载体的话，可以把试剂盒里的rTaq（或者LATaq）换成ExTaq，或者直接用高保真的系列PCR完再向体系中加点rTaq和dNTP72度处理5分钟给PCR产物加尾
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大家相互帮助哈
5楼2013-12-26 15:23:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:47
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图，重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读，人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外，你多送几个克隆去测序。
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2楼2013-12-26 11:13:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:58
其它位置发生突变当然有可能，任何PCR都有可能造成突变。主要是DNA聚合酶错配碱基造成的问题。
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3楼2013-12-26 11:15:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只要进行PCR就有突变的可能，可以优化一下你的PCR反应，比如稍增加模板的量，降低循环，或者使用试剂盒提供以外的高保真酶做PCR
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-12-26 14:53:35
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