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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于点突变 已有3人参与

各位大虾,求助如下:
       以各位大虾做点突变的经验,ORF框内除了target site突变,其它位置也有突变,这个一般是什么原因造成的?我用的是Takara的点突变试剂盒,目的片段在T载体上,总长3000多bp,在试剂盒要求的片段长度内。而且发现点突变总是在非target site位置的TTT处少一个T碱基,这是为什么?谢谢啦
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没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-26 11:13:24
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图,重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读,人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外,你多送几个克隆去测序。

嗯,我仔细检查了一下测序峰,其实测序结果非常好,非常单一没有重叠,感觉不大像是测序的结果,不过还是谢谢您的提醒!
没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
13楼2013-12-28 12:15:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:47
有可能是测序的问题。检查一下测序峰图,重叠部分以测序质量高的为准。非重叠部分也有可能由于质量不高而误读,人工纠正一些程序拼接造成的错误。此外,你多送几个克隆去测序。
2楼2013-12-26 11:13:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:03:58
其它位置发生突变当然有可能,任何PCR都有可能造成突变。主要是DNA聚合酶错配碱基造成的问题。
3楼2013-12-26 11:15:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
只要进行PCR就有突变的可能,可以优化一下你的PCR反应,比如稍增加模板的量,降低循环,或者使用试剂盒提供以外的高保真酶做PCR
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-12-26 14:53:35
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