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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近做转化快疯掉了
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] 最近做转化快疯掉了

因为定量DNA的nano好像不好用了，所以只能通过肉眼看DNA浓度。
    酶切胶回收后跑电泳，感觉浓度还可以，可是连接转化后，就是不长菌落！
   PCR产物连T载体成功，说明连接酶没问题。用对照质粒转化成功，说明转化没问题。难道是酶切这步有什么问题吗？
   做了好多次都失败了，要崩溃了，求大神帮助啊，给些指点。
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1楼 2013-11-07 22:22:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-09 01:34:57
酶切问题。酶切时最适合温度37度，不可以震荡，可以混匀，快速离心一下。酶切时间不宜过长，一般在10-15分钟。
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6楼2013-11-08 14:22:36
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普通回帖

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
肉眼看DNA浓度
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windleakey
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-11-07 22:52:42
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windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-11-07 22:52:42
肉眼看DNA浓度

琼脂糖电泳嘛，看亮度了，能给些建议不
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3楼2013-11-07 22:58:10
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-08 08:23:19
不知道你想表达啥意思？
说明白些好嘛？
是不是想将目的DNA连接至某vector呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2013-11-07 23:45:01
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-08 08:23:31
应该是酶切的问题, 楼主要连进去的片段是不是从T载体上面切下来的? 是的话可以排除这个方面的问题, 那么很有可能是目标载体出状况了, 重新切一份吧.
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5楼2013-11-08 06:16:42
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2013-11-07 23:45:01
不知道你想表达啥意思？
说明白些好嘛？
是不是想将目的DNA连接至某vector呢？

不好意思，好像我描述的确实有点不清楚，其实实验很简单，就是从T载体上把我的目的片段切下来连到表达载体上。酶切后琼脂糖电泳看，效果挺好的。胶回收后我也会跑个胶看一看。转化有对照所以没问题。所以不知道还可能有什么其他的问题
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7楼2013-11-08 21:30:45
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-11-08 06:16:42
应该是酶切的问题, 楼主要连进去的片段是不是从T载体上面切下来的? 是的话可以排除这个方面的问题, 那么很有可能是目标载体出状况了, 重新切一份吧.

没错是从T载体切下来，请问目标载体出状况指的是？我要连的两个载体确实都是向别人要的
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8楼2013-11-08 21:33:59
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yipan at 2013-11-08 14:22:36
酶切问题。酶切时最适合温度37度，不可以震荡，可以混匀，快速离心一下。酶切时间不宜过长，一般在10-15分钟。

恩，我的双酶切都是37度。10到15分钟这么短可以吗？我一般都3个小时呢？
枪吹打几次算剧烈不？我都会吹大混匀的。
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9楼2013-11-08 21:40:31
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-08 14:33:59
没错是从T载体切下来，请问目标载体出状况指的是？我要连的两个载体确实都是向别人要的...

各种想不到的状况......楼主请检查一下抗性标记有没有弄错, 另外最好对质粒的多克隆位点测一次序列
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10楼2013-11-08 22:36:11
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