11楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-08 23:43:52
如果你不确定是不是酶切问题，那你可以放一个对照。两个处理：（1）酶切的质粒+酶切片段（2）酶切的质粒不加目的片段。将两个都转化。如果你连酶切的质粒，不加插入片段的转化都有菌斑，那说明酶切是没成功。

9楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-08 21:40:31
恩，我的双酶切都是37度。10到15分钟这么短可以吗？我一般都3个小时呢？
枪吹打几次算剧烈不？我都会吹大混匀的。...

12楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-09 06:54:38
可是我的酶切的质粒加目的片段连接转化都没有菌落啊，那是不是说明质粒已经切开了，没有自连。
我在想会不会是我切的太狠了把粘性末端切坏了，请问这个有可能不？...

13楼: Originally posted by yujitianqing at 2013-11-10 08:40:44
有些是用快酶酶切的，所以时间很短，Takara、Fermentas都有生产快酶。若用普通Takara 限制酶的话，按照说明书是一个小时，当然可以延长，毕竟酶在运输过程中可能出现一些问题。后面你再看下选用的两种酶缓冲液是否 ...

15楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-10 11:53:07
那你可以缩短一下时间，但我觉得这不是主要问题，3小时不长。
你再反复确认一下你的PCR产物的酶切位点和质粒上的是否一样。再者你可以拿个其他的已经连上的gene的载体用相同的酶切一下，然后连到你要的载体上。这 ...