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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近做转化快疯掉了
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-09 01:35:09
如果你不确定是不是酶切问题，那你可以放一个对照。两个处理：（1）酶切的质粒+酶切片段（2）酶切的质粒不加目的片段。将两个都转化。如果你连酶切的质粒，不加插入片段的转化都有菌斑，那说明酶切是没成功。
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11楼2013-11-08 23:43:52
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-08 23:43:52
如果你不确定是不是酶切问题，那你可以放一个对照。两个处理：（1）酶切的质粒+酶切片段（2）酶切的质粒不加目的片段。将两个都转化。如果你连酶切的质粒，不加插入片段的转化都有菌斑，那说明酶切是没成功。

可是我的酶切的质粒加目的片段连接转化都没有菌落啊，那是不是说明质粒已经切开了，没有自连。
我在想会不会是我切的太狠了把粘性末端切坏了，请问这个有可能不？
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12楼2013-11-09 19:54:38
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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9楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-08 21:40:31
恩，我的双酶切都是37度。10到15分钟这么短可以吗？我一般都3个小时呢？
枪吹打几次算剧烈不？我都会吹大混匀的。...

有些是用快酶酶切的，所以时间很短，Takara、Fermentas都有生产快酶。若用普通Takara 限制酶的话，按照说明书是一个小时，当然可以延长，毕竟酶在运输过程中可能出现一些问题。后面你再看下选用的两种酶缓冲液是否合适或检查下会不会出现同步酶切效果差这方面的问题。
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windleakey
13楼2013-11-10 08:40:44
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我用于链接的双酶切都是过夜的，你要不把插入片段的量增加点试试，要不就是载体出问题了
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14楼2013-11-10 09:48:45
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-09 06:54:38
可是我的酶切的质粒加目的片段连接转化都没有菌落啊，那是不是说明质粒已经切开了，没有自连。
我在想会不会是我切的太狠了把粘性末端切坏了，请问这个有可能不？...

那你可以缩短一下时间，但我觉得这不是主要问题，3小时不长。
你再反复确认一下你的PCR产物的酶切位点和质粒上的是否一样。再者你可以拿个其他的已经连上的gene的载体用相同的酶切一下，然后连到你要的载体上。这样你就可以确认是不是你的酶切、连接体系有问题了。如果上面的可以，那很有可能是你的PCR产物的酶切出了问题。
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windleakey
15楼2013-11-10 11:53:07
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windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by yujitianqing at 2013-11-10 08:40:44
有些是用快酶酶切的，所以时间很短，Takara、Fermentas都有生产快酶。若用普通Takara 限制酶的话，按照说明书是一个小时，当然可以延长，毕竟酶在运输过程中可能出现一些问题。后面你再看下选用的两种酶缓冲液是否 ...

恩，谢谢建议，我再重新检查一下
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16楼2013-11-12 21:29:02
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windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-10 11:53:07
那你可以缩短一下时间，但我觉得这不是主要问题，3小时不长。
你再反复确认一下你的PCR产物的酶切位点和质粒上的是否一样。再者你可以拿个其他的已经连上的gene的载体用相同的酶切一下，然后连到你要的载体上。这 ...

恩，谢谢，我按照你说的试一试
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17楼2013-11-12 21:30:02
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看电泳亮度应该是很准的。除了酶切问题，抗生素也有可能，如果楼主用的是氨苄，建议加大浓度。对照质粒建议使用实验室已经成功的同类基因，试剂盒提供的质粒太牛了，一般没有很大参考价值，可以的话建议用另一端有人做过的基因酶切链接转化看看。
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18楼2013-11-13 02:11:04
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转化没有长菌落，这基本可以说明酶切是没有问题的，说明质粒被切开了，我觉得你在看亮度的时候没有考虑片段长度。一般来说，相同浓度的DNA，片段越长越亮，假如说有两段长度相同的DNA：a和b，a的亮度是b的5倍，那么可以认为a的浓度也是b的5倍；如果他们的浓度一样的话，同样可以认为a的长度是b的5倍。反推回去也是一样的。总之，亮度是由长度和浓度共同决定的。
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我给不了你宝马香车，锦衣玉食，但我会用一辈子去疼你，爱你，保护你
19楼2013-11-13 10:37:28
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wanghx_2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你可以先转化大肠杆菌做个模式反应看看，只要转化的大肠杆菌有转化子那就是链接成功了，是你的转化出了问题，还有就是请你说明是转的什么宿主，大致条件是什么。。这样好判断些
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20楼2013-11-13 10:47:02
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