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windleakey

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[求助] 最近做转化快疯掉了

因为定量DNA的nano好像不好用了，所以只能通过肉眼看DNA浓度。
酶切胶回收后跑电泳，感觉浓度还可以，可是连接转化后，就是不长菌落！
PCR产物连T载体成功，说明连接酶没问题。用对照质粒转化成功，说明转化没问题。难道是酶切这步有什么问题吗？
做了好多次都失败了，要崩溃了，求大神帮助啊，给些指点。

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1楼 2013-11-07 22:22:02

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sun_in_night

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引用回帖:

12楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-09 06:54:38
可是我的酶切的质粒加目的片段连接转化都没有菌落啊，那是不是说明质粒已经切开了，没有自连。
我在想会不会是我切的太狠了把粘性末端切坏了，请问这个有可能不？...

那你可以缩短一下时间，但我觉得这不是主要问题，3小时不长。
你再反复确认一下你的PCR产物的酶切位点和质粒上的是否一样。再者你可以拿个其他的已经连上的gene的载体用相同的酶切一下，然后连到你要的载体上。这样你就可以确认是不是你的酶切、连接体系有问题了。如果上面的可以，那很有可能是你的PCR产物的酶切出了问题。