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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近做转化快疯掉了
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] 最近做转化快疯掉了

因为定量DNA的nano好像不好用了，所以只能通过肉眼看DNA浓度。
    酶切胶回收后跑电泳，感觉浓度还可以，可是连接转化后，就是不长菌落！
   PCR产物连T载体成功，说明连接酶没问题。用对照质粒转化成功，说明转化没问题。难道是酶切这步有什么问题吗？
   做了好多次都失败了，要崩溃了，求大神帮助啊，给些指点。
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1楼 2013-11-07 22:22:02
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by windleakey at 2013-11-09 06:54:38
可是我的酶切的质粒加目的片段连接转化都没有菌落啊，那是不是说明质粒已经切开了，没有自连。
我在想会不会是我切的太狠了把粘性末端切坏了，请问这个有可能不？...

那你可以缩短一下时间，但我觉得这不是主要问题，3小时不长。
你再反复确认一下你的PCR产物的酶切位点和质粒上的是否一样。再者你可以拿个其他的已经连上的gene的载体用相同的酶切一下，然后连到你要的载体上。这样你就可以确认是不是你的酶切、连接体系有问题了。如果上面的可以，那很有可能是你的PCR产物的酶切出了问题。
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windleakey
15楼2013-11-10 11:53:07
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
肉眼看DNA浓度
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windleakey
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-11-07 22:52:42
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windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-11-07 22:52:42
肉眼看DNA浓度

琼脂糖电泳嘛，看亮度了，能给些建议不
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3楼2013-11-07 22:58:10
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-08 08:23:19
不知道你想表达啥意思？
说明白些好嘛？
是不是想将目的DNA连接至某vector呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2013-11-07 23:45:01
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