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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Ecoli BL21 DE3表达蛋白时突然变澄清，但非噬菌体污染，究竟是怎么回事？
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quxd

金虫 (正式写手)

[交流] Ecoli BL21 DE3表达蛋白时突然变澄清，但非噬菌体污染，究竟是怎么回事？ 已有11人参与

最近利用Ecoli BL21 DE3/pET28a生产蛋白，小摇瓶培养很正常,IPTG诱导后蛋白活性也很好；但在7L发酵罐中，起初培养还算正常，加入IPTG之后不久菌就越摇越稀，感觉像裂解了。检查噬菌斑也没有发现噬菌体污染，也尝试了各种培养基，也不行。不知各位有没有碰到过类似情况，该如何解决？

[ Last edited by quxd on 2013-10-31 at 12:16 ]
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1楼 2013-10-31 12:15:04
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lpzl

木虫 (正式写手)
★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-31 13:27:44
IPTG对细胞有毒性，会抑制菌生长，浓度时多少？还有啥时候加的？？一般在菌对数期加比较好。。。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-10-31 12:22:41
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jiangtailong

新虫 (初入文坛)
★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-31 22:24:07
诱导时od不能太低，一般在对数期中后期，注意补料跟进，菌体自溶可能是缺乏氮源，摇瓶多转接几次看是否有自溶，菌种复壮后再试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-10-31 13:35:32
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quxd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2013-10-31 12:22:41
IPTG对细胞有毒性，会抑制菌生长，浓度时多少？还有啥时候加的？？一般在菌对数期加比较好。。。

IPTG用的是0.1mM，OD在15-20的时候加的。是不是太老了？
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4楼2013-10-31 22:58:29
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eastrocket

木虫 (初入文坛)
★
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如该现象已经多次实验确证，应该是表达蛋白具有细胞毒性所致，该种诱因最明显的特点就是诱导后细胞逐渐死亡（死亡速度低于噬菌体感染），但仍然会存余活菌（质粒丢失所致）。如想避免，可降低温度，降低IPTG使用量，延长诱导时间试试；如果效果不明显，可换有细胞毒性耐受的宿主菌或对目标蛋白进行融合表达。

[ 发自小木虫客户端 ]

[ Last edited by eastrocket on 2013-11-1 at 06:05 ]
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7楼2013-11-01 05:43:35
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
★
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可能是N源的问题
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Never say never
9楼2013-11-01 10:28:36
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quxd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biowandy at 2013-11-01 04:03:10
肯定告诉你是噬菌体，你的检测不到位，导致你误判。

确实没有看到噬菌体斑
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13楼2013-11-02 16:20:23
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普通回帖

quxd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiangtailong at 2013-10-31 13:35:32
诱导时od不能太低，一般在对数期中后期，注意补料跟进，菌体自溶可能是缺乏氮源，摇瓶多转接几次看是否有自溶，菌种复壮后再试试

IPTG的浓度是0.1mM，一般在OD15-20的时候加的，是不是有点过老了？N源这块到时没有太注意，流加的时候也补加了一点，是不是需要摸索下？
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5楼2013-10-31 23:00:17
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biowandy

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
肯定告诉你是噬菌体，你的检测不到位，导致你误判。

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2013-11-01 04:03:10
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acvhreinlg

银虫 (正式写手)
★
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感染噬菌体概率不大吧

[ 发自小木虫客户端 ]
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科研是将金钱转换为知识的过程，而创新则是将知识转换为金钱的过程。
8楼2013-11-01 07:51:36
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欧阳-90

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我曾经也遇到过类似的情况，但是不是发酵罐的培养，而是0.6L摇瓶培养出现和你一样的情况，加了IPTG之后菌越来越澄清。已知找不到原因。只好每次接种前都是重新转化，不用甘油菌接种
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10楼2013-11-02 15:17:28
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