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遨游生命

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 有没有人验证过这篇文章的数据 已有3人参与

小虫在做实验时，查到了中科大田志刚教授在PNAS上的一篇文章，刚好有小鼠TLR3和TLR4这两个基因的引物，于是直接参考来用。结果这两个基因的引物都不好用，TLR4直接扩增不出来，TLR3明显具有非特性扩增。不知道有没有虫友也参考过这篇文章的引物序列做过这两个基因的扩增？或许是我的实验条件不合适？但是我用的是温度梯度检测，TLR3在几个温度下有明显非特异性扩增，此外的温度范围下没有特异性扩增。请各位虫友赐教，小虫不胜感激啊原文链接地址http://www.pnas.org/content/102/47/17077.full.pdf+html
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1楼 2013-10-15 09:15:16
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DAX1

新虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-16 09:11:06
楼主，要找到和你一样参考的概率应该极小哦。不知道你是做克隆还是半定量。换个酶试试，话说我这么多年做了大大小小克隆不下50个基因，从来没用过温度梯度检测，一直坚持用kod和phusion这两个酶。实在不行就发信问问他们具体实验操作呗，一般都会给回的。
Ps，八年前上过老田的免疫课，还是很不错的。
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2楼2013-10-16 04:20:15
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elbo

金虫 (小有名气)
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直接联系作者，请教一下。
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3楼2013-10-16 15:34:44
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-16 19:32:02
1.LZ做PCR之前即使用文献的引物也要先做blast和primer打分，即使是高水平文献引物写错的概率也是很高的。
2.PCR条件的摸索是比较闹心的，耐心的反复做，试试加DMSO，甘油之类的。
3.模板质量如何？PCR条件再好，模板差也不行呀。
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4楼2013-10-16 15:58:15
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遨游生命

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-10-16 15:58:15
1.LZ做PCR之前即使用文献的引物也要先做blast和primer打分，即使是高水平文献引物写错的概率也是很高的。
2.PCR条件的摸索是比较闹心的，耐心的反复做，试试加DMSO，甘油之类的。
3.模板质量如何？PCR条件再好，模 ...

出这两个基因为还有内参基因一个引物。这个内参基因的引物扩增的特异性很好。不知道为什么差别很大
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5楼2013-10-16 17:13:25
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by 遨游生命 at 2013-10-16 17:13:25
出这两个基因为还有内参基因一个引物。这个内参基因的引物扩增的特异性很好。不知道为什么差别很大...

我说的模板问题不仅包括提取的问题，还有基因在特定组织的表达差异，LZ和文献的实验材料来源有无差异？能否找到一定表达的阳性对照？受体的转录不是丰度非常高的，可能和细胞或组织的状态相关。
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6楼2013-10-16 20:08:00
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-10-16 20:08:00
我说的模板问题不仅包括提取的问题，还有基因在特定组织的表达差异，LZ和文献的实验材料来源有无差异？能否找到一定表达的阳性对照？受体的转录不是丰度非常高的，可能和细胞或组织的状态相关。...

补充一下，blast和primer5的评分必须做，要是blast结果不好就不要考虑了，几乎一定会有非特异。primer至少80分以上，最好95以上，否则很难优化PCR条件。
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7楼2013-10-16 20:15:45
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