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天湖酒

新虫 (初入文坛)

[求助] 提质粒,跑电泳发现量很少怎么回事?

我就是用试剂盒,按照说明书提的质粒,是两个菌的两个质粒一起提的,会有哪些可能导致提的质粒量很少呢?
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-11 22:36:45
操作的方法,不是说你按照说明书上操作就可以,提取的过程中速度要快,在这就是混匀的时候动作要尽量轻柔,不要剧烈混匀,
2楼2013-10-11 21:18:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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是高拷贝质粒还是低拷贝质粒?收的菌生长状态如何?
3楼2013-10-11 23:54:09
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929519755

金虫 (正式写手)

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1、菌体数量多少
2、试剂盒是否过期
3、操作是否正确
想你没话说
4楼2013-10-12 08:39:23
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

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还有,跑电泳的时候,拿标准跑对照了吗? 直接测一下,浓度多少,260/280的比例如何
行至水穷处,坐看云起时
5楼2013-10-12 11:59:14
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

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分析一下:你量少有两个原因,一,可能是质料本身就少;二,你提的过程中操作不好。
给你的建议是:一,可以多提点菌液,比如原来你只用了1ML的菌液,那现在你可以用3ml 5ml 甚至更多。只要重复的离心菌液就行了。
                     二,操作过程中,动作要温和,其中加碱和酸的这两步比较关键,可能试剂盒里有不同的名字比如QIA的叫P2,N3 ,天根的好像是叫P2,P3。 加碱上下颠倒几次,要轻柔。时间不要超过3min ,然后加酸中和就行了。

                     三,最后你就得检查下你的试剂盒是不是有问题,比如 wash buffer 是不是没有问题的。
6楼2013-10-12 16:25:10
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

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原因:菌体种类,摇菌的毫升数,以及你的质粒拷贝数是一个。举例:
我提的是pbad-hisa/myc,从20ml的菌液中提质粒,40微升溶解质粒,浓度为103ng/μl,我不会贴图要么就可以吧图给你看看了。
应助之星就是我~没错。你没有看错~
7楼2013-10-12 20:13:25
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王者归来001

木虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★ ★
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天湖酒: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-10-13 17:15:13
原因:1 菌体的类型,表达菌株的质粒量就很少;
2 试剂盒上的要求很重要,裂解菌体是否充分很重要,菌体过多就需要多加裂解液,否则质粒产量就会很低;
3 过柱时可放置5min,便于膜吸附质粒;
4  洗脱质粒时可重复洗两次。
坚持不懈,终会成功!
8楼2013-10-12 21:53:34
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