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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酵母转化之后表现出抗性，但pcr无法验证出来！求解
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 酵母转化之后表现出抗性，但pcr无法验证出来！求解 已有1人参与

请教各位虫友：
我把工业酿酒酵母制成单倍体后，第一：我将KanMX基因转化进酵母，通过同源置换后敲除了某个基因！筛选后，挑出转化子进行抗G418液体培养，结果表现出抗性（对照组不能抗G418）。
  第二 在此基础上我进行了PCR验证 引物分别为 a b c d ,其中a,d分别为被敲除基因的上下游引物；b,c分别为KanMX内部的引物。
     我的问题在于 PCR后有ab,cd扩增出的条带（但比预期的条带略大一些），此外 不管怎样P了5,6次就是P不出ad条带（我用未做转化的基因组模板P了ad，结果有条带出现）！
   我现在非常的纳闷，问题不知出在哪里，请求大家帮忙分析分析！
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1楼 2013-10-10 20:01:55
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-11-12 19:30:14
我也有同样的问题
帮你顶个
同求大侠解决

另外请问你
你的转化子要多久可以长出来呢？

现在问题解决了，两天可以长的比较好了
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5楼2013-12-16 20:44:59
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jincongcong at 2013-12-14 12:17:54
延伸时间时间加长，然后35+循环试试，原来我有个情况差不多的就是这么解决的

谢谢，解决了，用之前PCR buffer 和 DNTPMIXTURE没摇匀，摇匀后就P出来了
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-12-16 20:46:21
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普通回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
我也有同样的问题
帮你顶个
同求大侠解决

另外请问你
你的转化子要多久可以长出来呢？
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2楼2013-11-12 19:30:14
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

应该是引物的问题吧，送去合成的序列还在么，看看有没有弄错。
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3楼2013-11-12 22:38:18
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jincongcong

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

延伸时间时间加长，然后35+循环试试，原来我有个情况差不多的就是这么解决的
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4楼2013-12-14 12:17:54
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
内容已删除
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7楼2013-12-17 11:08:07
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-12-17 11:08:07
问一下你的酵母转化用什么方法 我的总是转不进去...

醋酸锂转化法啊！
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8楼2013-12-18 13:27:27
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
内容已删除
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9楼2013-12-18 23:18:36
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-12-18 23:18:36
细问一下，你也是在引物两端加45bp的同源序列，然后扩增KanMX片段得到敲除盒的么？...

是的是的！很方便啊
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10楼2013-12-24 16:38:58
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