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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 酵母转化之后表现出抗性,但pcr无法验证出来!求解 已有1人参与

请教各位虫友:
我把工业酿酒酵母制成单倍体后,第一:我将KanMX基因转化进酵母,通过同源置换后敲除了某个基因!筛选后,挑出转化子进行抗G418液体培养,结果表现出抗性(对照组不能抗G418)。
  第二 在此基础上我进行了PCR验证 引物分别为 a b c d ,其中a,d分别为被敲除基因的上下游引物;b,c分别为KanMX内部的引物。
     我的问题在于 PCR后有ab,cd扩增出的条带(但比预期的条带略大一些),此外 不管怎样P了5,6次就是P不出ad条带(我用未做转化的基因组模板P了ad,结果有条带出现)!
   我现在非常的纳闷,问题不知出在哪里,请求大家帮忙分析分析!
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-11-12 19:30:14
我也有同样的问题
帮你顶个
同求大侠解决

另外请问你
你的转化子要多久可以长出来呢?

现在问题解决了,两天可以长的比较好了
5楼2013-12-16 20:44:59
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jincongcong at 2013-12-14 12:17:54
延伸时间时间加长,然后35+循环试试,原来我有个情况差不多的就是这么解决的

谢谢,解决了,用之前PCR buffer 和 DNTPMIXTURE没摇匀,摇匀后就P出来了
6楼2013-12-16 20:46:21
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普通回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

我也有同样的问题
帮你顶个
同求大侠解决

另外请问你
你的转化子要多久可以长出来呢?
2楼2013-11-12 19:30:14
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

应该是引物的问题吧,送去合成的序列还在么,看看有没有弄错。
3楼2013-11-12 22:38:18
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jincongcong

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

延伸时间时间加长,然后35+循环试试,原来我有个情况差不多的就是这么解决的
4楼2013-12-14 12:17:54
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

内容已删除
7楼2013-12-17 11:08:07
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-12-17 11:08:07
问一下你的酵母转化用什么方法 我的总是转不进去...

醋酸锂转化法啊!
8楼2013-12-18 13:27:27
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

内容已删除
9楼2013-12-18 23:18:36
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-12-18 23:18:36
细问一下,你也是在引物两端加45bp的同源序列,然后扩增KanMX片段得到敲除盒的么?...

是的是的!很方便啊
10楼2013-12-24 16:38:58
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