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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 拟南芥突变体纯合子目的基因仍有表达！真心求助！
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冰凝东

金虫 (小有名气)

[求助] 拟南芥突变体纯合子目的基因仍有表达！真心求助！ 已有1人参与

购买的拟南芥T-DNA插入突变体（SALK and CS），T-DNA插入在启动子或者内含子区域都有，提取DNA经PCR鉴定出纯合子，但是以纯合子cDNA为模板进行PCR，仍然可以获得目的基因片段（已测序确定），引物是夸内含子区，且RNA做了DNA酶消化！几个突变体都是这样，不知道大家有么有类似经历，都快郁闷死了，老板天天骂，说是我的问题！真心请教高手解决问题……现行谢过……
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1楼 2013-09-25 18:06:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-09-27 16:14:03
冰凝东: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-29 14:43:27
突变体可以上TAIR查看, 在sequence viewer里面选你要看的基因区域就可以看到突变体的插入位置. 因为SALK/SAIL一直在更新的, 或许现在有在EXON插入的T-DNA.
T-DNA 大小一般10k 左右(把筛选标记的大小也算进去). 所以当T-DNA出现在基因里面时,转录的时候是完全可能把整个T-DNA一起转录出来再接着转录基因剩下的部分的(虽然TDNA里面自带转录终止片段的).
启动子一般认为是在转录起点前面2到3k的范围里面, 但是这只是一个很模糊的定义. 因为负责基因表达的启动子可以出现在基因里面(比如说AGAMOUS, 它的启动子在intron里面), 甚至3'的地方.
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4楼2013-09-26 19:11:04
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:15:04
Chen, M., and Thelen, J.J. (2013). ACYL-LIPID DESATURASE2 is required for chilling and freezing tolerance in Arabidopsis. Plant Cell 25, 1430-1444.

参考这篇paper吧，转录本降低的突变体，如果表型确定，也是可以用的。
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8楼2013-09-27 15:12:37
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香分子生物期待你的精彩 2013-09-26 00:06:01
有可能的, 突变体转录时可以顺带把T-DNA也转录出来, 然后T-DNA作为intron 被割掉...
楼主能定到插入在exon的突变体么?
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2楼2013-09-25 20:11:43
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冰凝东

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-09-25 20:11:43
有可能的, 突变体转录时可以顺带把T-DNA也转录出来, 然后T-DNA作为intron 被割掉...
楼主能定到插入在exon的突变体么?

谢谢！突变体是我的老板定的，不太清楚是否可以定到EXON的突变体。
我想问一下T-DNA一般多大？还有就是启动子区域插入T-DNA也有目的基因，这是为何？
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3楼2013-09-25 21:14:23
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:14:13
这种情况确实存在的，很多时候如果不是发过文章的突变体确实没有影响到转录和表型。不知道你怎么鉴定的，有些突变体虽然没有完全敲除掉，但可能会表达量降低，也会出现表型的，只要达到你实验目的就行了。建议用定量PCR检测一下。
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5楼2013-09-27 11:05:40
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:14:47
还有就是引物位置的问题，我觉得做好跨插入位点设计引物检测。
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6楼2013-09-27 11:07:52
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 16:14:53
这种情况很常见，不是所有的T-DNA插入突变体都是完全缺失转录本的，有一些是转录本表达下降，有一些会导致只有部分转录本，比如只有T-DNA插入位点前方的半截。

如果没有合适的T-DNA突变体，可以考虑做RNAi或者artificial microRNA
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7楼2013-09-27 15:09:14
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冰凝东

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangpeng227 at 2013-09-27 15:12:37
Chen, M., and Thelen, J.J. (2013). ACYL-LIPID DESATURASE2 is required for chilling and freezing tolerance in Arabidopsis. Plant Cell 25, 1430-1444.

参考这篇paper吧，转录本降低的突变体，如果表型确定 ...

非常感谢……
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9楼2013-09-29 14:34:15
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冰凝东

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zgb1982 at 2013-09-27 11:07:52
还有就是引物位置的问题，我觉得做好跨插入位点设计引物检测。

非常感谢！如果插入位点在ATG之前，如何设计引物进行检测？？
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10楼2013-09-29 14:36:41
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