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wybiology

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[交流] 测序需要生物学重复！（转载）

新一代测序技术被誉为测序技术中的“工业革命”，作为基因组学研究的主要技术手段之一，它有着令人振奋的优点：
 更加灵活，可检测任何物种，不受探针设计限制，能发现新的核酸序列；
 更加灵敏，能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本；
 更加精确，数字化信号，单核苷酸分辨率的精度。

Question：新一代测序技术是否需要生物学重复？
Answer：需要。测序技术离不开生物学重复！

在过去的几年中，由于新一代测序技术的优越性以及高成本，导致了部分杂志编辑忽略了 “生物学重复”的重要性。但是，随着测序技术应用的推广和成本降低，杂志编辑对文章的要求也不断提高，严谨的实验设计会越来越受到优秀杂志的青睐。2011年7月发表在《Nature Biotechnology》上的一篇文章为研究者以及杂志审稿人敲响了警钟——测序技术并不能消除生物学差异。和芯片技术一样，测序技术也需要生物学重复！

文章中，研究者将两组转录组测序数据（生物学重复样本数分别为n=60和n=69）和对应的表达谱芯片数据（n=43, n=51）进行比对。结果发现，用测序和芯片技术研究相同的细胞，同一基因在不同生物学重复样本间表达水平的差异（SD值）是相似的（图a和图b）。结果说明，生物学差异是基因表达自身的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。

同时，研究者用测序技术和芯片分别检测COX4NB和RASGRP1基因。结果发现，同一实验组内，COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下RASGRP1的生物学差异很大（图c）。

结果意味着：不同实验组间COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。所以，设计的实验如果没有生物学重复，或者生物学重复的数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果；获得的差异表达的基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映疾病或者某种特定生理状态的群体本质特征。由此可见，生物学重复对于测序实验的设计以及实验数据的解读和分析非常重要。

上图：应用测序和芯片技术研究相同细胞系，比较两种技术的得到的数据的生物学差异。

(a) 基因表达的生物学差异（SD值）散点图。
X 轴：芯片数据的标准偏差值（样本量n=43）

Y 轴：测序数据的标准偏差值（样本量n=60）
(b) 另一组数据的生物学差异（SD值）散点图。
X 轴：芯片数据的标准偏差值（样本量n=51）
Y 轴：测序数据的标准偏差值（样本量n=69）
(c) COX4NB和RASGRP1基因在生物学重复样本中表达值的散点图。

左边红色：COX4NB基因表达值的散点图生物通
右边蓝色：RASGRP1基因达值的散点图
上面一行：测序数据的散点图生物通
下面一行：芯片数据的散点图

参考文献：Sequencing technology does not eliminate biological variability. Kasper D Hansen, Zhijin Wu, Rafael A Irizarry & Jeffrey T Leek. Nat Biotechnol., 2011. 29(7): 572–573.

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