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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提RNA的技术问题以及改进的建议
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hellohuo

金虫 (小有名气)

[求助] 提RNA的技术问题以及改进的建议

1.我用的是天根的提取液；
2.操作都是在冰上进行，但是提出来的结果还是不理想；
3.在氯仿抽提的时候，也尽量没有抽到中间的沉淀及下面的液体。
但是这样的结果很不理想，我要做QPCR，所以要对RNA的质量要求比较高，故请教各位大虾，希望大家能给一些改进的意见和建议，越多越好，谢谢~~~
提RNA的技术问题以及改进的建议
2013.8.6RNA提取.JPG

[ Last edited by 1949stone on 2013-9-9 at 16:16 ]
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1楼 2013-09-03 09:41:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

随波逐刘

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-05 14:34:42
引用回帖:
11楼: Originally posted by hellohuo at 2013-09-05 09:16:46
我提的是植物的叶子，我用的天根的提取液，对于多糖多酚的根是没问题的，也没有基因组污染。就是叶子的不行，降低了样品的量，可还是有点降解和基因组污染，所以很困惑为什么根的RNA没问题，叶子的问题反而比较大？...

有用过其他方法吗？我用CTAB法提过叶子的，还挺好的！
CTAB-LiCl沉淀法提取RNA
1. 将2×CTAB 提取液于65℃水浴锅中预热。取0.1-0.2g样品于液氮中研磨成粉末
2. 转入2ml离心管中，加700ul提取液，同时加20ulβ-巯基乙醇
3. 剧烈振荡混匀，65℃水浴10 min，期间振荡数次
4. 冷却到室温，加等体积氯仿:异戊醇(24:1)，充分振荡，冰浴10min
5. 4℃，12000g，离心10 min
6. 取上清至新2ml离心管，重复上述步骤，再抽提1次
7. 取上清于1.5ml离心管中，加入1/4体积的10 mol/L LiCl溶液
8. 4℃条件下过夜，或-20℃下放置6 h 以上，使RNA 沉淀
9. 4℃，12000g，离心20 min，弃上清，获粗提的总RNA 沉淀
10. 用500ul ddH2O溶解，加等体积氯仿/异戊醇（24:1）再抽提1次
11. 4℃，12000g，离心10min
12. 取上清，加1/10体积3mol/LNaAc（PH5.2），混匀后，加等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀2-3h
13. 4℃，12000g，离心10min，弃上清，用75%乙醇洗沉淀2次
14. 短暂离心吸出多余液体，室温干燥，ddH2O溶解，-80℃保存
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12楼2013-09-05 14:06:00
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你看我的贴更悲剧，唉，目前还没找到原因
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2楼2013-09-03 17:43:45
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-09-03 17:43:45
你看我的贴更悲剧，唉，目前还没找到原因

哎，提RNA是各种问题啊，你遇到了什么情况啊？
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3楼2013-09-04 09:26:57
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随波逐刘

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:00:58
hellohuo: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-05 09:17:49
有基因组污染啊，降解也有点严重了，估计还是提取方法不太好，用过trizol没有，至少DNA去的比较干净。。可以试一下！
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4楼2013-09-04 10:50:04
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fanwq258

木虫 (正式写手)
基因组DNA污染较严重，还有就是降解太严重了，
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
5楼2013-09-04 13:08:09
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 随波逐刘 at 2013-09-04 10:50:04
有基因组污染啊，降解也有点严重了，估计还是提取方法不太好，用过trizol没有，至少DNA去的比较干净。。可以试一下！

用的是天根的trizol······
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6楼2013-09-04 14:32:18
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-09-04 13:08:09
基因组DNA污染较严重，还有就是降解太严重了，

应该在哪些问题上注意些呢？
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7楼2013-09-04 14:33:20
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fanwq258

木虫 (正式写手)
一个字“快”，每一步都争取最短时间内完成
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hellohuo
要么好好活，要么死，拒绝半死不活
8楼2013-09-04 17:28:22
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随波逐刘

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:01:09
引用回帖:
7楼: Originally posted by hellohuo at 2013-09-04 14:33:20
应该在哪些问题上注意些呢？...

不是吧，trizol应该基因组dna去的很彻底啊。。。我买的是invitrogen公司的，100ml650元，效果还可以。。。当时提的是植物根部组织，糖类酚类物质较多，改进了下trizol，效果不错还实惠。。。你提的是什么组织？
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9楼2013-09-04 18:26:33
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hellohuo

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-09-04 17:28:22
一个字“快”，每一步都争取最短时间内完成

恩，谢谢，我尽量再提高速度。本来想送金币，但是这个不是应助贴，我也不懂再怎么额外送，所以送朵花吧，谢谢你的建议~
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10楼2013-09-05 09:14:30
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