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hellohuo

金虫 (小有名气)

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[求助] 提RNA的技术问题以及改进的建议

1.我用的是天根的提取液；
2.操作都是在冰上进行，但是提出来的结果还是不理想；
3.在氯仿抽提的时候，也尽量没有抽到中间的沉淀及下面的液体。
但是这样的结果很不理想，我要做QPCR，所以要对RNA的质量要求比较高，故请教各位大虾，希望大家能给一些改进的意见和建议，越多越好，谢谢~~~

2013.8.6RNA提取.JPG

[ Last edited by 1949stone on 2013-9-9 at 16:16 ]

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1楼 2013-09-03 09:41:22

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随波逐刘

新虫 (小有名气)

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★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-05 14:34:42

引用回帖:

11楼: Originally posted by hellohuo at 2013-09-05 09:16:46
我提的是植物的叶子，我用的天根的提取液，对于多糖多酚的根是没问题的，也没有基因组污染。就是叶子的不行，降低了样品的量，可还是有点降解和基因组污染，所以很困惑为什么根的RNA没问题，叶子的问题反而比较大？...

有用过其他方法吗？我用CTAB法提过叶子的，还挺好的！
CTAB-LiCl沉淀法提取RNA
1. 将2×CTAB 提取液于65℃水浴锅中预热。取0.1-0.2g样品于液氮中研磨成粉末
2. 转入2ml离心管中，加700ul提取液，同时加20ulβ-巯基乙醇
3. 剧烈振荡混匀，65℃水浴10 min，期间振荡数次
4. 冷却到室温，加等体积氯仿:异戊醇(24:1)，充分振荡，冰浴10min
5. 4℃，12000g，离心10 min
6. 取上清至新2ml离心管，重复上述步骤，再抽提1次
7. 取上清于1.5ml离心管中，加入1/4体积的10 mol/L LiCl溶液
8. 4℃条件下过夜，或-20℃下放置6 h 以上，使RNA 沉淀
9. 4℃，12000g，离心20 min，弃上清，获粗提的总RNA 沉淀
10. 用500ul ddH2O溶解，加等体积氯仿/异戊醇（24:1）再抽提1次
11. 4℃，12000g，离心10min
12. 取上清，加1/10体积3mol/LNaAc（PH5.2），混匀后，加等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀2-3h
13. 4℃，12000g，离心10min，弃上清，用75%乙醇洗沉淀2次
14. 短暂离心吸出多余液体，室温干燥，ddH2O溶解，-80℃保存