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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 亚细胞定位。。。
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)

[求助] 亚细胞定位。。。

请问在构建亚细胞定位载体时，要通过PCR扩增目的基因终止密码子之前的序列用于构建融合蛋白，我有两个问题想请教：
1，ATG（起始密码子）之前的一些序列（约几十bp）连到载体上对结果有没有影响？
2，若终止密码子前的序列GC含量高，二级结构有些复杂，设计引物扩增存在一定的困难，可否有其他解决途径去获得用于够载体的序列？
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1楼2013-08-19 20:33:19
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-20 11:31:43
yangjianchen: 金币+3, ★有帮助 2013-08-20 16:13:09
不知道你reporter放在N 还是C端。放在N端那么1就有问题，放在C端1就没有问题。
如果放在reporter放在N端，PCR primer 可以设提到终止密码子以后，不影响定位和表达。如果放在C端，直接设计，PCR的时候加DMSO，看是否可行。
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Let'sdoit.
2楼2013-08-19 21:49:32
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-20 11:31:51
yangjianchen: 金币+5, ★有帮助 2013-08-20 16:13:24
关于问题1，如果你使用载体本身ATG的话就可能有问题，因为你做定位，N端可能存在信号肽，你加入ATG前面序列，而你载体本身也有ATG就麻烦了，同时你也要考虑载体ATG与你基因ATG直接的序列。
问题2， 你所谓的GC有多高？我用过近80%的GC引物，都没有问题。Good luck！
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yangjianchen
互助互励，共奋共进！！
3楼2013-08-19 22:05:14
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-19 22:05:14
关于问题1，如果你使用载体本身ATG的话就可能有问题，因为你做定位，N端可能存在信号肽，你加入ATG前面序列，而你载体本身也有ATG就麻烦了，同时你也要考虑载体ATG与你基因ATG直接的序列。
问题2， 你所谓的GC有多 ...

谢谢啊，确实高GC未必不能扩增，只是可能难度有点高吧！还是决定尝试一下。
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4楼2013-08-20 11:18:52
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-19 21:49:32
不知道你reporter放在N 还是C端。放在N端那么1就有问题，放在C端1就没有问题。
如果放在reporter放在N端，PCR primer 可以设提到终止密码子以后，不影响定位和表达。如果放在C端，直接设计，PCR的时候加DMSO，看是 ...

reporter放在C端。谢谢啊！另外想请教如果reporter放在C端的话，表达蛋白完整编码框（已去除end codon的情况下）与reporter之前有一些序列（3的倍数个碱基）对表达是否有影响？影响如何？
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5楼2013-08-20 11:21:47
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
yangjianchen: 金币+2, ★有帮助, 恩，谢谢啊！努力尝试下！ 2013-08-20 16:12:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by yangjianchen at 2013-08-20 04:21:47
reporter放在C端。谢谢啊！另外想请教如果reporter放在C端的话，表达蛋白完整编码框（已去除end codon的情况下）与reporter之前有一些序列（3的倍数个碱基）对表达是否有影响？影响如何？...

应该对表达应该影响不大。因为正常构建过程中也会产生相应的序列。比如梅切序列等。
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Let'sdoit.
6楼2013-08-20 15:38:07
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