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zgfxray

金虫 (小有名气)

[求助] PCR延长核苷酸序列

想通过PCR在目的蛋白N端加8个氨基酸应该怎么操作?求帮助
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1 2013-08-19 07:49:01
zgfxray: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-19 16:20:37
zgfxray: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-20 08:53:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by zgfxray at 2013-08-18 11:12:18
谢谢,那么重叠区域多长好呢,如果前面非重叠区太长,重叠区只有10个bp的话,短不短?而且,如果引物太长的话,会不会对PCR有影响,最长多长可以容忍?TM最高多高?谢谢
...

8*3=24,24+10=34,这个长度不算太长,而且跟你模板结合的实际上只有10,所以TM值只算那10个而已,你在设计引物下订单的时候说明这个情况,叫公司也计算那10个的TM值就行。

但是一般来说,10个碱基的引物TM值是不高的,跟你另一端引物配合起来的时候退火温度不好确定,所以你可以设计长一点,15或者20个25个都行,那么就是8*3=24,24+25=49,实际结合的引物长度为25。具体设计多长就看你的实际需要,要看看另一端取多少个碱基,特异性怎样,TM值先用vector nti来算,最好别太高,五十几六十度就行,最终可以设计得到实际跟模板结合约20个碱基的一对引物,注意,是实际结合而不是引物总长度。
PCR延长核苷酸序列
图片1.jpg

流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2013-08-18 17:02:03
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普通回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zgfxray: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-18 11:06:09
在你的那一端取10个碱基设计成引物,再在该引物5'端加上你那些氨基酸的编码序列
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2013-08-17 20:39:35
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zgfxray

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-17 20:39:35
在你的那一端取10个碱基设计成引物,再在该引物5'端加上你那些氨基酸的编码序列

谢谢,那么重叠区域多长好呢,如果前面非重叠区太长,重叠区只有10个bp的话,短不短?而且,如果引物太长的话,会不会对PCR有影响,最长多长可以容忍?TM最高多高?谢谢

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3楼2013-08-18 11:12:18
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2013-08-19 07:49:56
zgfxray: 金币+1, 有帮助 2013-08-19 16:21:28
设计重叠PCR引物的时候,记住一个原则,那就是上下游两段序列的重叠部分为有效引物,所以一般还是设计25bp把退火温度控制在60℃以上。Good luck!
互助互励,共奋共进!!
5楼2013-08-19 06:54:39
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zgfxray

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-18 17:02:03
8*3=24,24+10=34,这个长度不算太长,而且跟你模板结合的实际上只有10,所以TM值只算那10个而已,你在设计引物下订单的时候说明这个情况,叫公司也计算那10个的TM值就行。

但是一般来说,10个碱基的引物TM值是不 ...

非常谢谢,我这儿有个问题,就是tm值是根据重叠区域来算吗?我设计的引物44bp,重叠区域14bp,根据primer5我设计的引物最低tm值显示86度,也就是说这个值不对呗,还有,我是不是要告诉引物合成公司我的引物重叠区域只有14bp?再次感谢

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6楼2013-08-19 23:19:57
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

引用回帖:
6楼: Originally posted by zgfxray at 2013-08-19 23:19:57
非常谢谢,我这儿有个问题,就是tm值是根据重叠区域来算吗?我设计的引物44bp,重叠区域14bp,根据primer5我设计的引物最低tm值显示86度,也就是说这个值不对呗,还有,我是不是要告诉引物合成公司我的引物重叠区域 ...

86度很高,我觉得还是别合成这条引物吧,你计算引物TM值的时候只把结合的那部分计算,不包括不结合的部分,再算一次试试。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2013-08-19 23:46:02
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zgfxray

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-19 23:46:02
86度很高,我觉得还是别合成这条引物吧,你计算引物TM值的时候只把结合的那部分计算,不包括不结合的部分,再算一次试试。...

好的,谢谢你了

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8楼2013-08-20 08:51:36
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