24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 1372  |  回复: 7
本帖产生 1 个 BioEPI ,点击这里进行查看

zgfxray

金虫 (小有名气)

[求助] PCR延长核苷酸序列

想通过PCR在目的蛋白N端加8个氨基酸应该怎么操作?求帮助
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

认真对待每件事
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1 2013-08-19 07:49:01
zgfxray: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-19 16:20:37
zgfxray: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-20 08:53:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by zgfxray at 2013-08-18 11:12:18
谢谢,那么重叠区域多长好呢,如果前面非重叠区太长,重叠区只有10个bp的话,短不短?而且,如果引物太长的话,会不会对PCR有影响,最长多长可以容忍?TM最高多高?谢谢
...

8*3=24,24+10=34,这个长度不算太长,而且跟你模板结合的实际上只有10,所以TM值只算那10个而已,你在设计引物下订单的时候说明这个情况,叫公司也计算那10个的TM值就行。

但是一般来说,10个碱基的引物TM值是不高的,跟你另一端引物配合起来的时候退火温度不好确定,所以你可以设计长一点,15或者20个25个都行,那么就是8*3=24,24+25=49,实际结合的引物长度为25。具体设计多长就看你的实际需要,要看看另一端取多少个碱基,特异性怎样,TM值先用vector nti来算,最好别太高,五十几六十度就行,最终可以设计得到实际跟模板结合约20个碱基的一对引物,注意,是实际结合而不是引物总长度。
PCR延长核苷酸序列
图片1.jpg

流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2013-08-18 17:02:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zgfxray: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-18 11:06:09
在你的那一端取10个碱基设计成引物,再在该引物5'端加上你那些氨基酸的编码序列
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2013-08-17 20:39:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgfxray

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-17 20:39:35
在你的那一端取10个碱基设计成引物,再在该引物5'端加上你那些氨基酸的编码序列

谢谢,那么重叠区域多长好呢,如果前面非重叠区太长,重叠区只有10个bp的话,短不短?而且,如果引物太长的话,会不会对PCR有影响,最长多长可以容忍?TM最高多高?谢谢

[ 发自小木虫客户端 ]
认真对待每件事
3楼2013-08-18 11:12:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2013-08-19 07:49:56
zgfxray: 金币+1, 有帮助 2013-08-19 16:21:28
设计重叠PCR引物的时候,记住一个原则,那就是上下游两段序列的重叠部分为有效引物,所以一般还是设计25bp把退火温度控制在60℃以上。Good luck!
互助互励,共奋共进!!
5楼2013-08-19 06:54:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgfxray

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-18 17:02:03
8*3=24,24+10=34,这个长度不算太长,而且跟你模板结合的实际上只有10,所以TM值只算那10个而已,你在设计引物下订单的时候说明这个情况,叫公司也计算那10个的TM值就行。

但是一般来说,10个碱基的引物TM值是不 ...

非常谢谢,我这儿有个问题,就是tm值是根据重叠区域来算吗?我设计的引物44bp,重叠区域14bp,根据primer5我设计的引物最低tm值显示86度,也就是说这个值不对呗,还有,我是不是要告诉引物合成公司我的引物重叠区域只有14bp?再次感谢

[ 发自小木虫客户端 ]
认真对待每件事
6楼2013-08-19 23:19:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

引用回帖:
6楼: Originally posted by zgfxray at 2013-08-19 23:19:57
非常谢谢,我这儿有个问题,就是tm值是根据重叠区域来算吗?我设计的引物44bp,重叠区域14bp,根据primer5我设计的引物最低tm值显示86度,也就是说这个值不对呗,还有,我是不是要告诉引物合成公司我的引物重叠区域 ...

86度很高,我觉得还是别合成这条引物吧,你计算引物TM值的时候只把结合的那部分计算,不包括不结合的部分,再算一次试试。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2013-08-19 23:46:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgfxray

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-19 23:46:02
86度很高,我觉得还是别合成这条引物吧,你计算引物TM值的时候只把结合的那部分计算,不包括不结合的部分,再算一次试试。...

好的,谢谢你了

[ 发自小木虫客户端 ]
认真对待每件事
8楼2013-08-20 08:51:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zgfxray 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂求调剂 +10 121. 2026-04-02 10/500 2026-04-08 08:42 by 蓝云思雨
[考研] 264求调剂 +9 麦小叮当 2026-04-07 9/450 2026-04-08 01:52 by Linzejun
[考研] 计算机408|在校多次国家级竞赛获奖|申请调剂 +4 东山大白鹅 2026-04-05 4/200 2026-04-08 00:18 by chongya
[考研] 调剂求助(生物与医药) +6 @6952 2026-04-06 6/300 2026-04-07 23:52 by lys0704
[考研] 344求调剂 +11 魏子per 2026-04-07 11/550 2026-04-07 23:01 by JourneyLucky
[考研] 材料工程322 +14 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-07 15/750 2026-04-07 22:51 by 来看流星雨10
[考研] 一志愿郑州大学材料与化工085600,求调剂 +34 吃的不少 2026-04-02 34/1700 2026-04-07 20:01 by lrll?l
[考研] 化学调剂 +18 艾志恒 2026-04-03 19/950 2026-04-07 16:00 by 起飞的比熊1
[考研] 334分机械专硕求调剂 +3 蛋花紫菜汤 2026-04-03 3/150 2026-04-07 14:49 by 逍遥cocoa
[考研] 285求调剂 +15 哦呦呼o 2026-04-04 17/850 2026-04-06 23:02 by chenzhimin
[考研] (调剂)一志愿报考哈尔滨工业大学0857资源与环境专业378分考生 +7 狠狠加油 2026-04-05 8/400 2026-04-06 16:52 by momo皓
[考研] 301求调剂 +3 XYPLR 2026-04-05 4/200 2026-04-05 19:07 by XYPLR
[考研] 321求调剂 +6 认真求上学 2026-04-03 6/300 2026-04-04 19:51 by dongzh2009
[考研] 359求调剂 +7 hhhhaaaa$ 2026-04-04 7/350 2026-04-04 18:49 by imissbao
[考研] 一志愿南农090401,268,求调剂 +5 一木鸟然 2026-04-04 5/250 2026-04-04 17:07 by babysonlkd
[考研] 350一志愿北京航空航天大学08500材料科学与工程求调剂 +5 kjnasfss 2026-04-03 5/250 2026-04-03 22:29 by 无际的草原
[考研] 一志愿华中农业071010,总分320求调剂 +7 困困困困坤坤 2026-04-02 7/350 2026-04-03 17:26 by Yuena_Wang
[考研] 326分求调剂 +3 于是乎呢 2026-04-01 5/250 2026-04-03 14:23 by 于是乎呢
[考研] 262求调剂 +6 励志一定发文章 2026-04-02 7/350 2026-04-03 09:54 by linyelide
[考研] 08生物与医药专硕初试346找调剂 +6 dianeeee 2026-04-01 7/350 2026-04-02 08:23 by guoweigw
信息提示
请填处理意见