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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR延长核苷酸序列
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zgfxray

金虫 (小有名气)

[求助] PCR延长核苷酸序列

想通过PCR在目的蛋白N端加8个氨基酸应该怎么操作？求帮助
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认真对待每件事
1楼2013-08-17 15:26:44
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
6楼: Originally posted by zgfxray at 2013-08-19 23:19:57
非常谢谢，我这儿有个问题，就是tm值是根据重叠区域来算吗？我设计的引物44bp,重叠区域14bp，根据primer5我设计的引物最低tm值显示86度，也就是说这个值不对呗，还有，我是不是要告诉引物合成公司我的引物重叠区域 ...

86度很高，我觉得还是别合成这条引物吧，你计算引物TM值的时候只把结合的那部分计算，不包括不结合的部分，再算一次试试。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2013-08-19 23:46:02
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zgfxray: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-18 11:06:09
在你的那一端取10个碱基设计成引物，再在该引物5'端加上你那些氨基酸的编码序列
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2013-08-17 20:39:35
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zgfxray

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-17 20:39:35
在你的那一端取10个碱基设计成引物，再在该引物5'端加上你那些氨基酸的编码序列

谢谢，那么重叠区域多长好呢，如果前面非重叠区太长，重叠区只有10个bp的话，短不短？而且，如果引物太长的话，会不会对PCR有影响，最长多长可以容忍？TM最高多高？谢谢

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认真对待每件事
3楼2013-08-18 11:12:18
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1 2013-08-19 07:49:01
zgfxray: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-19 16:20:37
zgfxray: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-20 08:53:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by zgfxray at 2013-08-18 11:12:18
谢谢，那么重叠区域多长好呢，如果前面非重叠区太长，重叠区只有10个bp的话，短不短？而且，如果引物太长的话，会不会对PCR有影响，最长多长可以容忍？TM最高多高？谢谢
...

8*3=24,24+10=34，这个长度不算太长，而且跟你模板结合的实际上只有10，所以TM值只算那10个而已，你在设计引物下订单的时候说明这个情况，叫公司也计算那10个的TM值就行。

但是一般来说，10个碱基的引物TM值是不高的，跟你另一端引物配合起来的时候退火温度不好确定，所以你可以设计长一点，15或者20个25个都行，那么就是8*3=24,24+25=49，实际结合的引物长度为25。具体设计多长就看你的实际需要，要看看另一端取多少个碱基，特异性怎样，TM值先用vector nti来算，最好别太高，五十几六十度就行，最终可以设计得到实际跟模板结合约20个碱基的一对引物，注意，是实际结合而不是引物总长度。
PCR延长核苷酸序列
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2013-08-18 17:02:03
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