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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 尿素胶跑DNA（PCR产物），变性不完全
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eiieen

新虫 (小有名气)

[求助] 尿素胶跑DNA（PCR产物），变性不完全

用尿素胶跑PCR产物，发现杂带很多，疑DNA变性不完全。
求：尿素胶的loading buffer配方
求：DNA变性完全的方法
（本实验必须用变性胶跑DNA）
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1楼 2013-08-17 10:37:13
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周圆圆1989

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-08-17 21:09:12
6×Loading buffer:
　　30mM EDTA
　　36%(v/v) Glycerol
　　0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF
　　0.05%(w/v) Bromophenol Blue
DNA变性不完全会不会是尿素的问题，因为我也没跑过几次变性的PAGE，我也不清楚
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2楼2013-08-17 16:47:22
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by eiieen at 2013-08-18 12:00:49
尿素聚丙烯酰胺胶
胶的配方没问题
我想确认的是，loding buffer配方噢...

我用的是RNA loading dye，不过这个染料也能用于DNA相关实验，配方如下：
RNA loading buffer
10 ml
9.5 ml                100% Formamide (Deionized Formamide)
100 μl                0.5M EDTA
25 μl                10% SDS
100 μl                2.5% BFB (“blue”)
100 μl                2.5% CFF (“purple”)
175 μl                MQ
-------------------------------------------
10 ml                Total
需要在通风厨中操作~
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5楼2013-08-19 02:23:43
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
★
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-08-17 21:09:19
不知道是尿素葡聚糖胶还是尿素聚丙烯酰胺胶，如果是后者，网上配方挺多，我一般用含有7M尿素的体系，加入loading dye之后95度温育5分钟再点样跑胶。希望对楼主有帮助~
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3楼2013-08-17 18:46:58
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eiieen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aaa0001984 at 2013-08-17 18:46:58
不知道是尿素葡聚糖胶还是尿素聚丙烯酰胺胶，如果是后者，网上配方挺多，我一般用含有7M尿素的体系，加入loading dye之后95度温育5分钟再点样跑胶。希望对楼主有帮助~

尿素聚丙烯酰胺胶
胶的配方没问题
我想确认的是，loding buffer配方噢
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4楼2013-08-18 12:00:49
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by eiieen at 2013-08-18 12:00:49
尿素聚丙烯酰胺胶
胶的配方没问题
我想确认的是，loding buffer配方噢...

这个染料配方是2X loading dye，不过我经常也就是加点显色，没有按照1:1的比例加~
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6楼2013-08-19 02:24:24
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eiieen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aaa0001984 at 2013-08-19 02:24:24
这个染料配方是2X loading dye，不过我经常也就是加点显色，没有按照1:1的比例加~...


配方中没有甘油，加样的时候，样品好沉吗
MQ是什么，O(∩_∩)O谢谢
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7楼2013-08-19 12:19:50
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by eiieen at 2013-08-19 12:19:50

配方中没有甘油，加样的时候，样品好沉吗
MQ是什么，O(∩_∩)O谢谢...

我用的没问题，如果按照1：1的比例混合，95度加热五分钟后离心甩一下，点样的时候样品沉的挺快的。你可以先试试看呢。另外，我是用的是垂直的跑胶系统。
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8楼2013-08-19 21:26:29
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by eiieen at 2013-08-19 12:19:50

配方中没有甘油，加样的时候，样品好沉吗
MQ是什么，O(∩_∩)O谢谢...

MQ是MilliQ water，也就是超纯水了。因为我的样品是RNA，所以都用超纯水防止RNase污染~
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9楼2013-08-19 21:27:59
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eiieen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by aaa0001984 at 2013-08-19 21:27:59
MQ是MilliQ water，也就是超纯水了。因为我的样品是RNA，所以都用超纯水防止RNase污染~...

有做过样品是DNA的吗
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10楼2013-08-27 09:38:30
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