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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 抑制差减杂交（SSH）的RNA纯化要求
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[求助] 抑制差减杂交（SSH）的RNA纯化要求

如题，我想做抑制差减杂交（SSH）发现空白与与处理组的差异基因。但是这个RNA要求就很高。我看过相关文献及使用说明书，知道它用量大，且质量要好。   
    但是关于RNA纯化这一块，在纯化得到mRNA之前，是否需要先用DNA消化酶消化掉DNA再去纯化mRNA比较好？如果提取得到总RNA后，直接过柱纯化得到mRNA，省掉消化DNA那步，会对mRNA的质量有很大影响吗？mRNA纯化，另外有无比较好的牌子推荐下呢？
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思路决定出路。。。
1楼 2013-07-22 16:45:59
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流,静待高手来 2013-07-23 15:48:30
发现最近我发的帖子都没人回复的？
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思路决定出路。。。
2楼2013-07-23 14:32:36
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lmcyjxs: 金币+2, ★有帮助, 总算有人回复了，谢谢。那有去总RNA中的DNA吗？其实，我是看到很多人都纯化了，但是另一方面想，纯化后，RNA的种类难免就会损失，因此纠结中。。。 2013-07-23 18:21:59
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-17 20:50:16
以前用总RNA都能做出来，不需要纯化出mRNA
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3楼2013-07-23 16:32:56
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-17 20:50:02
哦，对了，还有就是貌似用kit提的RNA
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4楼2013-07-23 16:34:33
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hyphen007 at 2013-07-23 16:34:33
哦，对了，还有就是貌似用kit提的RNA

那试剂盒提的话，一般都有去DNA的试剂和步骤的。
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思路决定出路。。。
5楼2013-07-23 18:23:12
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随波逐刘

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也是刚做完SSH。
总结一下，还是RNA这块最关键了。。关系到这个文库的质量好坏。
首先：RNA肯定的是mRNA，总RNA什么的肯定不行，即使做出来文库，也是垃圾序列居多，没有什么价值。mRNA分离我用的是磁珠法，promego公司的，挺便宜的，质量也不错，因为SSH起始RNA量大嘛，所以没有跑电泳，做完反转录之后才检查cDNA的质量，弥散，质量还可以，之前一直也是各种担心，因为肉眼很难看到，mRNA有没有提出来啊，反转录之后离心，能看到一点点的小沉淀的。。。如果DNA组明显多的话，还是得加DNase消化的，对RNA影响不大。。。
正在做后续的实验，做SSH的小虫貌似不多，希望能互相交流。。。做久了感觉心好累。。。感觉不会再做SSH了，老板今儿又说再做一个文库。。。。。
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6楼2013-09-16 23:25:32
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 随波逐刘 at 2013-09-16 23:25:32
我也是刚做完SSH。
总结一下，还是RNA这块最关键了。。关系到这个文库的质量好坏。
首先：RNA肯定的是mRNA，总RNA什么的肯定不行，即使做出来文库，也是垃圾序列居多，没有什么价值。mRNA分离我用的是磁珠法，pro ...

谢谢这位虫友的热心交流帮助！真心表示很能理解你的心情~加油！祝你一切顺顺利利的！以后多多请教啦！
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思路决定出路。。。
7楼2013-09-17 20:47:37
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哈啦啦2012

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主好！我最近也在做SSH，接头连接这块出现问题了，我买的试剂盒里没有做两次PCR需要的酶，我用SMART RACE试剂盒里的酶做，第一次PCR结果啥都没出来，接头连接效率也啥都没出来，好头疼啊，不知道是接头没连接上，还是酶的问题，用这个酶做普通的PCR能P出条带来。我酶切后纯化的ds cDNA检测了有条带啊。不知道到底哪里出问题了。希望能互相交流学习下吧。
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8楼2013-11-06 17:09:30
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