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fanglei1hao

新虫 (初入文坛)

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[交流] BL21同源转化已有4人参与

大家好，我最近在做BL21的同学转化，我想插入一个基因到BL21的chromosome里面，但是我一直都不成功，我是用氯霉素作为antibiotic resistance gene在我要插入的基因之后，我用的是PKD46质粒的，然后我有几个疑问，

第一就是pKD46的induction OD point。
第二个是是否要降低氯霉素的浓度，氯霉素很用以引起自身的变异。
第三个是我的 PCR targeting product的大小是4.9KB，其中同源壁的长度是200bp，is that sufficient?
第四个是这个BL21 strain, 其中recA基因已经被knocked out，这个会不会影响到转化？
第五个是induce 的时常，有人和我说他induce之后是看时间的，比如3个小时，但是那个时候可能OD已经是0.8，这时候在做competent cell会不会有点老了？
我总是被告知做B系列的很难，我想问下这里有没有成功的同学或者正在努力的同学共同讨论分享下经验。

谢谢

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1楼 2013-07-21 05:13:51

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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

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没做过B系列不过pkd46这个用的pbad promoter可能不如psim系列的PL+CI857好
induction@OD=0.1（略小也没关系，但我觉得不要太晚） clora是比较难做得，不过长出来的基本一定是对的，（控制在5-10ug/ml）
4.9kb很大，在K系列里面我同实验室的用psim19做大片段，一次大概就1-2个阳性
recA没看出有关系，反正我操作克隆菌株时候感觉效率还高点（可能和endA有关）
3h太时间太长了，pbad大概1h，OD0.3-0.4比较好，psim的PL大概15min就够了（不过B系列不知道）

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1626079/#!po=25.0000
这个文章试了些不同条件，不过我对他们实验有点怀疑。。