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fanglei1hao

新虫 (初入文坛)

[交流] BL21同源转化 已有4人参与

大家好，我最近在做BL21的同学转化，我想插入一个基因到BL21的chromosome里面，但是我一直都不成功，我是用氯霉素作为antibiotic resistance gene在我要插入的基因之后，我用的是PKD46质粒的，然后我有几个疑问，

第一就是pKD46的induction OD point。
第二个是是否要降低氯霉素的浓度，氯霉素很用以引起自身的变异。
第三个是 我的 PCR targeting product的大小是4.9KB，其中同源壁的长度是200bp，is that sufficient?
第四个是这个BL21 strain, 其中recA基因已经被knocked out， 这个会不会影响到转化？
第五个是induce 的时常，有人和我说他induce之后是看时间的，比如3个小时，但是那个时候可能OD已经是0.8，这时候在做competent cell会不会有点老了？
我总是被告知做B系列的很难，我想问下这里有没有成功的同学或者正在努力的同学共同讨论分享下经验。

谢谢
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1楼 2013-07-21 05:13:51
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