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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于合成的引物DNA序列在260nm处没有吸收峰，是怎么回事？？
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xingxingkids

金虫 (著名写手)

[求助] 关于合成的引物DNA序列在260nm处没有吸收峰，是怎么回事？？

合成的引物，经过离心溶解后，进行紫外测试，结果在260nm处竟然没有吸收峰，请问可能是什么原因，谢谢！！
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1楼2013-06-08 17:24:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我现在也不清楚205、340、345nm处的峰是什么。用10000r离心了5min，可能是速度高了些，因为引物DNA是单链，一反面可能剪切力作用切割ssDNA更明显，另一方面，单链DNA在离心力作用下可能形成不规则的线团状结构，又由于磷酸是亲水的，其包裹在在外面，碱基在线团状结构的内部，导致了碱基紫外吸收峰被遮蔽。样品浓度大概在10 的负7次方左右这个浓度应该不高。
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6楼2013-06-08 18:41:06
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xingxingkids: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢您的耐心解答。我会按照您的说法再去试一下，谢谢！！ 2013-06-09 12:23:48
引用回帖:
4楼: Originally posted by xingxingkids at 2013-06-08 17:55:32
请问长时间离心会对DNA有什么影响吗？？我是先用4000r离心5min，后来不放心又用10000r离心了5min，然后就加TE溶液溶解了。...

我查了一下具体的用紫外光测定DNA的实验流程，楼主的离心机转速也太猛了。如果待测核酸中含有酸溶性的核苷酸或聚合的多核苷酸，则需要用钼酸铵-过氯酸沉淀剂（钼酸铵0.25%,过氯酸2.5%)沉淀离心后取上清液测定紫外260nm吸收峰。钼酸铵-过氯酸沉淀剂（钼酸铵0.25%,过氯酸2.5%)制备方法:取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水。
具体去除酸溶性的核苷酸或聚合的多核苷酸的实验流程是：0.5mL 样品DNA溶液和0.5mL蒸馏水，放入离心管A；0.5mL 样品DNA溶液和0.5mL蒸馏水，放入离心管B，钼酸铵-过氯酸沉淀剂摇匀，冰浴30分钟，以3000转/分离心10分钟。然后分别从离心管A和离心管B中分别吸取0.4mL上清液到50mL容量瓶内，定容到刻度。于紫外光光度计测定260nm处吸收峰。
你的实验因为不需要测定DNA样品的具体浓度，所以可以直接用蒸馏水作对照。但是你的离心机的转速也未免太太大了。
另外说一下DNA溶液的浓度：每mL含有核酸（单链DNA，双链DNA，RNA均可）5-50微克即可测定260nm和280nm的吸收峰，双链DNA的每个碱基对的平均分子量是618.
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7楼2013-06-08 23:21:36
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是离心后剪切力过大，粉碎了DNA，或者DNA被水解了，你用电泳测试一下。
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2楼2013-06-08 17:30:19
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
xingxingkids: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-06-08 18:03:31
xingxingkids(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-09 09:34:27
是不是你的样品浓度太大了，这时紫外光谱可能测不来。如果你的样品中可能混有其他的大分子DNA则要用钼酸铵-过氯酸沉淀剂（钼酸铵0.25%,过氯酸2.5%)沉淀离心后取上清液测定紫外260nm吸收峰。钼酸铵-过氯酸沉淀剂（钼酸铵0.25%,过氯酸2.5%)制备方法:取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水。
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3楼2013-06-08 17:45:14
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xingxingkids

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-08 17:30:19
是不是离心后剪切力过大，粉碎了DNA，或者DNA被水解了，你用电泳测试一下。

请问长时间离心会对DNA有什么影响吗？？我是先用4000r离心5min，后来不放心又用10000r离心了5min，然后就加TE溶液溶解了。
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4楼2013-06-08 17:55:32
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xingxingkids

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-08 17:45:14
是不是你的样品浓度太大了，这时紫外光谱可能测不来。如果你的样品中可能混有其他的大分子DNA则要用钼酸铵-过氯酸沉淀剂（钼酸铵0.25%,过氯酸2.5%)沉淀离心后取上清液测定紫外260nm吸收峰。钼酸铵-过氯酸沉淀剂（钼 ...

先谢谢您。样品浓度大概在10 的负7次方左右，不知道这样浓度算不算太大？奇怪的是在205、340、345nm登处竟然出峰了。
下面是测试的紫外光谱图。
关于合成的引物DNA序列在260nm处没有吸收峰，是怎么回事？？
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5楼2013-06-08 18:02:26
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xingxingkids

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-08 18:41:06
我现在也不清楚205、340、345nm处的峰是什么。用10000r离心了5min，可能是速度高了些，因为引物DNA是单链，一反面可能剪切力作用切割ssDNA更明显，另一方面，单链DNA在离心力作用下可能形成不规则的线团状结构，又由 ...

您好，我想确定一下，为什么有人说12000rpm处理5min绝对不会损坏DNA呢？？
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8楼2013-06-14 21:00:55
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
xingxingkids: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-06-15 11:03:28
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8楼: Originally posted by xingxingkids at 2013-06-14 21:00:55
您好，我想确定一下，为什么有人说12000rpm处理5min绝对不会损坏DNA呢？？...

DNA是线状高分子，12000rpm处理5min引起的剪切力绝对不可能不会损坏DNA！不信直接用质谱检测12000rpm处理5min前后的DNA的分子量的质谱峰有没有变化。

有人说12000rpm处理5min绝对不会损坏DNA呢？？----其实验依据是什么？！------有人还说上帝存在哪！

如果你认为：你合成的DNA是否出现在溶液中有问题，最简单的试验检测方法，直接用MS检测溶液中的生物大分子的相对分子量！
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9楼2013-06-14 23:16:25
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xingxingkids

金虫 (著名写手)
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9楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-14 23:16:25
DNA是线状高分子，12000rpm处理5min引起的剪切力绝对不可能不会损坏DNA！不信直接用质谱检测12000rpm处理5min前后的DNA的分子量的质谱峰有没有变化。

有人说12000rpm处理5min绝对不会损坏DNA呢？？----其实验依 ...

真的非常感谢您，真理是客观的，通过排除我已经基本确定，我的DNA前处理主要问题出在离心时间与转速上。我打算改用4000r处理5min，使得DNA从管壁上离心下来，又不破坏它。谢谢！！！
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10楼2013-06-15 11:03:19
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