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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNAi表达载体构建后，酶切切不开，怎么回事？
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风诺2010

铜虫 (小有名气)

[求助] RNAi表达载体构建后，酶切切不开，怎么回事？

我有3个目的片段，分别在800,700和500左右，采用一步法与表达载体pBI-121植物表达载体连接，没有采用构建中间载体的方法， 但是我想这也不影响我的酶切吧，我用PCR检测都有结果，PCR结果都显示3个片段都连上了，但是就是酶切切不了，用同样的酶切其他的质粒都能切开，就是切这个RNAi表达载体切不了，怎么回事，求大侠指点。之后再加50金币。跪求。。。。。。。
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1楼 2013-06-01 21:21:22
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雄鹰飞翔

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
风诺2010: 金币+5, ★有帮助 2013-06-30 17:08:20
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-30 17:18:16
个人分析，问题可能是：
1）酶切位点有问题，因为有些平末端的酶切位点，切割后在连接后就不可以在切割开来；
2）酶切体系有问题，主要是酶活性的失活，导致切不开
3)同时注意质粒的浓度
祝你好运！
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3楼2013-06-06 10:44:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
风诺2010(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-02 13:29:54
换酶切位点检验试试，不要用连接时的位点，有时候就是有这种莫名其妙的问题。
酶切验证无误之后，再测下序，妥妥的
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2楼2013-06-01 21:42:32
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

既然都连到表达载体了，直接送测序吧，反正要测下有没有突变啊
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4楼2013-06-06 13:10:15
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治愈系柠檬茶

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
风诺2010: 金币+5 2013-06-30 17:09:25
先改用其他的酶切位点试一试 如果能切开就是内切酶的问题，不是体系不对就是位点突变，如果切不开就是你的质粒样品的问题，样品蛋白太多也会影响酶切
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5楼2013-06-08 17:08:00
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